По производству: Завод по производству и переработке полиэтилена низкого давления — Кинотеатр "Художественный" кино, афиша, киноафиша, анонс, рейтинг, новость, кинотеатр, кинотеатры Москвы, кинофильм, прокат, лучший, Россия, Москва, кинотеатр Художественный

Содержание

Завод по производству и переработке полиэтилена низкого давления

Директор —

МУЗАФАРОВ РУСТЕМ РАФИКОВИЧ

Удельный вес завода в продукции ПАО“Казаньоргсинтез”

54,6%

Численность работающих на заводе

861

Завод по производству и переработке полиэтилена низкого давления (ПППНД) состоит из трех производств:

Производство полиэтилена

Получение полиэтилена осуществляется (со)полимеризацией этилена газофазным методом по технологии Unipol с применением катализаторов.

Завод производит различные марки полиэтилена:
— полиэтилен высокой плотности;
— бимодальный полиэтилен высокой плотности;
— полиэтилен средней плотности;
— линейный полиэтилен низкой плотности;
— металлоценовый линейный полиэтилен низкой плотности.

Выпускаемые продукты предназначены для переработки методом экструзии выдувного, ротационного и литьевого формования, производства пленочных материалов, напорных труб для газо- и водоснабжения.

Производство пластмассовых изделий

В качестве сырья использует ПЭНД и ПЭ100. Производит полиэтиленовые труб, и соединительные детали для газо- и водоснабжения.

Производство труб из полиэтилена осуществляется методом экструзии, детали к ним изготавливают методами литья под давлением, прессования, намотки и сварки.

Полиэтиленовые трубы широко применяются в системах газоснабжения, водоснабжения, канализации, системах технологических трубопроводов. Производство полиэтиленовых труб и соединительных деталей входит в тройку ведущих в России.

Производство сомономеров

В качестве сырья используется этилен. Конечная продукция-бутен-1, получаемый димеризацией этилена.

Бутен-1 находит применение в качестве сомономера-модификатора для производства ПНД высокой, средней плотности, линейного полиэтилена низкой плотности.

КАТАЛОГ ПРОДУКЦИИ

США и ЕС договорились о прекращении спора по производству Boeing и Airbus

https://ria.ru/20210615/spor-1737081185.html

США и ЕС договорились о прекращении спора по производству Boeing и Airbus

США и ЕС договорились о прекращении спора по производству Boeing и Airbus — РИА Новости, 15.06.2021

США и ЕС договорились о прекращении спора по производству Boeing и Airbus

США и ЕС договорились об урегулировании торгового спора о производителях самолетов Boeing и Airbus, по которому были введены многомиллиардные взаимные пошлины,… РИА Новости, 15.06.2021

2021-06-15T14:38

2021-06-15T14:40

китай

airbus

евросоюз

сша

экономика

/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content

/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content

https://cdn25. img.ria.ru/images/151692/48/1516924816_0:0:2001:1126_1920x0_80_0_0_b2bdfa5082c685e08aff2e6eddf1a750.jpg

ВАШИНГТОН, 15 июн — РИА Новости. США и ЕС договорились об урегулировании торгового спора о производителях самолетов Boeing и Airbus, по которому были введены многомиллиардные взаимные пошлины, сообщила журналистам торговый представитель США в ранге министра Кэтрин Тай.По ее словам, США хотели продемонстрировать лидерство среди других демократических стран.»Сегодняшнее объявление, что США и ЕС достигли 5-летнего соглашения по 16-летнему спору Boeing-Airbus, служит этой цели. Это устраняет долгосрочный торговый раздражитель в отношениях США и Европы», — заявила Тай.Кроме того, по ее словам, США и ЕС договорились и о совместном противостоянии КНР.»Мы согласились работать вместе, чтобы бросать вызов и противостоять нерыночным действиям Китая в этом секторе конкретными способами, которые отражают наши стандарты честной конкуренции», — сказала Тай. По ее словам, в частности, речь идет о сотрудничестве по инвестициям и трансфертам технологий.

https://ria.ru/20210615/kitay-1736978090.html

китай

сша

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

2021

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

Новости

ru-RU

https://ria.ru/docs/about/copyright.html

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

https://cdn22.img.ria.ru/images/151692/48/1516924816_0:0:1629:1222_1920x0_80_0_0_3a9da138568d0ba9fcfe9f69c87acb3c.jpg

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

РИА Новости

internet-group@rian. ru

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

китай, airbus, евросоюз, сша, экономика

США и ЕС договорились о прекращении спора по производству Boeing и Airbus

14:38 15.06.2021 (обновлено: 14:40 15.06.2021)

Директор по производству | Семинары Moscow Business School

Директор по производству — один из ключевых руководителей на предприятии.

Он отвечает за исправную работу производственных циклов и качество изготавливаемой продукции. Также он занимается формированием смет по материалам, управляет производством, следит за наличием сырья.

Должность директора по производству требует большой ответственности, ведь специалист, полностью отвечающий за качество выпускаемой продукции, отвечает и за сохранность «лица» предприятия.

Должностные обязанности

Координация технической подготовки производства
Руководство коллективом
Контроль производства продукции в соответствии с заказами

Анализ финансовой стороны производственного процесса
Контроль состояния производственного оборудования
Разработка мероприятий по повышению производительности работ
Организация производственного учета
Ведение технической документации

Также в обязанности директора по производству также могут входить:

Подбор и обучение сотрудников
Автоматизирование процессов производства

Профессиональные навыки и качества

Для успешной работы в качестве директора по производству кандидату необходимо обладать следующими профессиональными и личностными качествами:

Высшее техническое образование
Дополнительное образование в сфере управления производством (желательно)
Опыт работы на производстве и на руководящих должностях
Знание актуальных технологий производства
Умение быстро принимать решения и устранять возникающие экстренные ситуации

Умение работать в сжатые сроки

Директор по производству должен быть находчивым и активным, чтобы оперативно реагировать на планы по созданию новой продукции, поступающие от сбытового и маркетингового подразделений.

К тому же специалист должен прекрасно понимать генерального директора, чтобы все экстренные и спорные вопросы решались быстро и эффективно.

Вы можете пройти обучение на практических бизнес-семинарах Moscow Business School, если хотите сменить сферу деятельности или укрепить свои позиции на текущем месте.

Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио»

Руководство

Межерицкий Александр Анатольевич

Директор

Директор филиала в г. Нижний Новгород «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио»

История филиала

В 1929 году на базе губернской санитарно-бактериологической станции, губернской пастеровской станции и губернской малярийной станции был организован краевой санитарно-бактериологический институт, который в 1933 г. был преобразован в краевой институт эпидемиологии и микробиологии.

В 1940 году в структуре института был выделен производственный отдел, выпускавший вакцины, сыворотки и другие иммунобиологические препараты. В 1960 году Приказом Минздрава РФ на базе этого отдела было создано в предприятие в составе Горьковского НИИ эпидемиологии и микробиологии.

В 1992 год произошло выделение из состава института самостоятельного юридического лица — Нижегородского предприятия по производству бактерийных препаратов фирма «ИмБио», в ведении Министерства здравоохранения Российской Федерации.

С 16 июня 2003г. предприятие реорганизовано в Филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио».

Среди препаратов, выпускаемых Филиалом, ведущее место занимают иммуноглобулины и препараты крови, такие как иммуноглобулин человека нормальный для внутривенного введения, специфические иммуноглобулины, комплексный иммуноглобулиновый препарат для перорального применения (КИП), альбумин, церулоплазмин. С начала 70-х годов прошлого века начато производство первого в стране специфического антистафилококкового иммуноглобулина, за создание которого ряду сотрудникам института и цеха гаммаглобулинов была присуждена Государственная премия.

Значимой группой в номенклатуре Филиала являются бактериофаги. Цех бактериофагов – старейшее в стране производство, начало которому положено в 1941г. выпуском бактериофага против возбудителей дизентерии, актуального в годы войны инфекционного заболевания. В настоящее время Нижегородский филиал обладает самой большой номенклатурой бактериофагов среди отечественных производителей.

Так же существенную долю в объеме производства занимают пробиотики — бифидумбактерин, лактобактерин, колибактерин в разных лекарственных формах. На Нижегородском предприятии, одном из первых в стране, была освоена технология производства бифидумбактерина сухого, а в 1975 году — выпуск таблетированных форм пробиотиков. В 1978 году препарат бифидумбактерин в таблетках был использован в практике космической медицины, и в 1984 году он получил серебряную медаль ВДНХ. С 1998г. по 2000г. был освоен выпуск новых лекарственных форм пробиотиков в суппозиториях, а также комплексного препарата — бификол.

В начале 70-х годов прошлого века как новое направление выделилось производство диагностических систем. В настоящее время номенклатура выпускаемых диагностических препаратов представлена моноспецифическими сыворотками, системами индикаторными бумажными, иммуноферментными тест-системами. Последняя разработка специалистов цеха — иммуноферментная тест-система для количественного определения антител к НВsAg (МикрАТ-НВs), выпускается по оригинальной технологии с 2010 года.

Нижегородский филиал располагает собственной научно-исследовательской базой и проводит прикладные научные исследования в области создания и модернизации лекарственных средств и технологий их производства. Основные результаты научно-производственной деятельности предприятия защищены патентами и авторскими свидетельствами

Линия по производству минеральных удобрений (NPK-удобрений)

Описание

Для агропромышленного комплекса предлагается линия по производству минеральных NPK-удобрений. Данная линия предназначена для производства гранулированных минеральных удобрений, таких как калий хлористый, сульфат аммония, и пр.

Производство гранул NPK-удобрений осуществляется по следующим размерам зернистости на выходе готовой продукции: от 0,5 мм до 20 мм. Исходным сырьём в производстве гранулированных удобрений служат минеральные соли в порошкообразном состоянии. Линия гранулирования позволяет смешивать несколько видов порошкообразных удобрений, при этом обеспечивает непрерывное производство гранул благодаря встроенным узлам. Управление линией осуществляется посредством установленного электрического шкафа управления.

Характеристики линии

Производительность продукции около 4000 кг/час

Диаметр валика 650 мм

Действительная ширина 300-400 мм

Скорость вращения валика 10-25 об./мин.

Максимальное давление формирования 35 мПа

Максимальная формовочная толщина 30 мм

Формовочная производительность 12000 кг/час

Зернистость продукции 0,5-20 мм

Размер гранул на выходе зависит от размеров ячеек сетки

Мощность главной машины 90кв

Мощность установки 200кв

Габариты линии 4000*3500*13000мм

Состав линии по производству удобрений

Вертикальный конвейер (поставляется в разобранном виде) 1шт.

Выгрузочная мягкая соединительная труба для вертикального конвейера 1шт.

Загрузочная соединительная труба для конусного принудительного питателя 1 шт.

Конусный принудительный питатель (поставляется в разобранном виде) 1 шт.

Формовочная главная машина (поставляется в разобранном виде) 1 шт.

Выгрузочная мягкая соединительная труба для формовочной главной машины 1шт.

Загрузочная соединительная труба для дробилки 1 шт.

Дробилка 1 шт.

Соединительная труба от дробилки до грануляционного устройства 1шт.

Грануляционное устройство для производства1 шт.

Выгрузочная соединительная труба для грануляционного устройства 1 шт.

Выгрузочная мягкая соединительная труба для грануляционного устройства 1 шт.

Сортировочная сетка 1 шт.

Выгрузочная мягкая соединительная труба для сортировочной сетки 1 шт.

Выгрузочная соединительная труба сортировочной сетки по продукции 1 шт.

Выгрузочная соединительная труба возврата для сортировочной сетки 1 шт.

Электрический шкаф (поставляется в разобранном виде) 1 шт.

Подача удобрений NPK на конвейер

Первым этапом при производстве гранулированных удобрений является подача исходных химических веществ на всю высоту технологической линии. Подача исходного сырья осуществляется посредством встроенного вертикального конвейера- автоподъёмника.

В системе вертикальной конвейерной подачи предусмотрены защитные металлические кожухи в виде сборных секций. Сырьё зачерпывается и подаётся наверх ковшами-черпалками. Передвижение встроенных ковшей-черпалок для загребания и поднятия сырья осуществляется от работы электродвигателя через шкив и ремни передачи. Поступательное движение на линии по производству удобрений NPK передается на специальную встроенную металлическую концевую цепь, к которой на расстоянии 500 мм друг от друга прикреплены болтами отдельные ковши-черпалки.

Такая вертикальная установка конвейера позволяет значительно сэкономить рабочее место в занимаемом пространстве всей линии.

Первичная формовка NPK удобрений листков (производство полуфабриката на линии)

Подающееся сырьё подвергается первичной формовке, образуя полуфабрикат. Производство полуфабриката (формовка листков) осуществляется встроенное формовочной главной машиной.

Формовочная главная машина линии по производству удобрений NPK приводится в действие отдельным встроенным электродвигателем, который обеспечивает крутящий момент винтовой лопасти. Сырье, которое поступает в формовочную машину линии перемешивается, слипается и подвергается сжатию. На прокатных валиках формовочной машины присутствует фильера (небольшая прорезь), обеспечивающая создание нужной конфигурации полоски полуфабриката, через которую хорошо перемешанная однородная масса сырья выдавливается в полоски путем механического давления.

Получаемый в формовочной машине полуфабрикат – «листки» — это отдельные куски однородного хорошо перемешанного материала в виде полосок с приблизительными размерами 250*10*8 мм. На толщине полосок полуфабриката присутствует небольшая дуга.

Дробление удобрений на линии по производству

Полуфабрикат, т.е. однородные листки материала, полученные в формовочной машине, поступает далее вниз для дробления.

Дробилка линии по производству удобрений приводится в действие отдельным встроенным электродвигателем, который обеспечивает бесперебойную и качественную работу. Дробление осуществляется благодаря встроенным лопастям.

Формовка гранул на линии

Листки материала, раздробленные в устройстве дробления, попадают по двум встроенным бункерам в грануляционное устройство, где из неравномерных кусков раздробленного полуфабриката формируются более однородные гранулы нужного размера. Грануляционное устройство линии по производству удобрений NPK является нижней частью единой собранной конструкции с устройством дробления.

Основная задача данного устройства для производства заключается в исправлении и придании необходимых соответствующих размеров гранулам.

Грануляционное устройство приводится в действие отдельным встроенным электродвигателем. Приводимые в движение лопасти устройства придают определенный размер гранул.

Сортировка гранул удобрения NPK на линии

Сортировка гранул на линии по производству удобрений NPK осуществляется после попадания в устройство сортировки. В данном устройстве устанавливается специальная сортировочная сетка с соответствующими размерами ячеек, в зависимости от нужных производимых размеров гранул. Сортировочную сетку можно менять в зависимости от необходимых размеров гранул.

Линия — система выхода готовых гранул NPK при производстве

После сортировки гранулы поступают в специальную трубку подачи готовых гранул NPK. Данная трубка относится к одному из встроенных узлов линии и называется выгрузочной соединительной трубкой сортировочной сетки по продукции.

Возврат на повторное смешивание более мелких гранул удобрения на повторную переработку

В работе линии предусмотрено устройство возврата гранул на повторную переработку. Встроенный узел выгрузочной соединительной трубки возврата для сортировочной сетки предусматривает попадание гранул вниз на конвейер для повторной переработки. Данная трубка устанавливается под соответствующим углом, чем обеспечивает беспрепятственное попадание гранул на конвейер для повторной переработки.

Цена

Формирование цены на линию по производству минеральных удобрений NPK зависит от состава и комплектности.

Для получения коммерческого предложения обратитесь к сотрудникам нашей компании:

Tel: +7 (958) 146-08-50; +7 (961) 758-70-10

E-mail: [email protected]

ЧАСТЬ V УНИЧТОЖЕНИЕ ОБЪЕКТОВ ПО ПРОИЗВОДСТВУ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ И ЕГО ПРОВЕРКА СОГЛАСНО СТАТЬЕ V

A. ОБЪЯВЛЕНИЯ

Объявления объектов по производству химического оружия

В объявлении объектов по производству химического оружия, представляемом государством-участником согласно пункту 1 с) ii) статьи III, по каждому объекту приводится:
1. наименование объекта, имена владельцев и названия компаний или предприятий, эксплуатирующих объект с 1 января 1946 года;
2. точное местоположение объекта, включая адрес, местонахождение комплекса, местонахождение объекта в пределах комплекса, включая конкретный номер здания и сооружения, если таковые имеются;
3. заявление относительно того, является ли он объектом по производству химикатов, определенных в качестве химического оружия, или объектом по снаряжению химического оружия, или же и тем, и другим;
4. дата завершения строительства объекта и периоды, в течение которых были произведены любые модификации объекта, включая установку нового или модифицированного оборудования, которые существенно изменили характеристики производственного процесса объекта;
5. информация о произведенных на объекте химикатах, определенных в качестве химического оружия; о снаряженных на объекте боеприпасах, устройствах и контейнерах; а также даты начала и прекращения такого производства или снаряжения:
  1. для произведенных на объекте химикатов, определенных в качестве химического оружия, такая информация выражается в виде конкретных категорий произведенных химикатов с указанием химического наименования в соответствии с действующей номенклатурой Международного союза чистой и прикладной химии (ЮПАК), структурной формулы и регистрационного номера по “Кемикл абстрактс сервис”, если таковой присвоен, и в виде количества каждого химиката, выражаемого весом химиката в тоннах;
  2. для снаряженных на объекте боеприпасов, устройств и контейнеров такая информация выражается в виде конкретной категории снаряженного химического оружия и веса химического снаряжения на единицу;
6. производственная мощность объекта по производству химического оружия:
  1. для объекта, на котором производилось химическое оружие, производственная мощность выражается в виде ежегодного количественного потенциала для производства конкретного вещества исходя из фактически используемого технологического процесса или, в случае пока еще не используемых процессов, исходя из процесса, который планируется использовать на объекте;
  2. для объекта, на котором снаряжалось химическое оружие, производственная мощность выражается в виде количества химиката, которым объект может снаряжать каждый конкретный вид химического оружия в год;
7. по каждому неуничтоженному объекту по производству химического оружия – описание объекта с указанием:
  1. плана места;
  2. технологической блок-схемы объекта; и
  3. инвентарного перечня зданий на объекте, а также специализированного оборудования на объекте и любых запасных частей для такого оборудования;
8. нынешнее состояние объекта с указанием:
  1. даты, когда на объекте было в последний раз произведено химическое оружие;
  2. был ли объект уничтожен, включая дату и способ его уничтожения; и
  3. был ли объект использован или модифицирован до вступления в силу настоящей Конвенции для деятельности, не связанной с производством химического оружия, и если был, то представляется информация о том, какие модификации были осуществлены, приводится дата начала такой деятельности, не связанной с химическим оружием, и характер такой деятельности с указанием, в соответствующих случаях, типа продукта;
9. характеристика мер по закрытию объекта, которые были приняты государством-участником, а также описание мер по выводу объекта из эксплуатации, которые были или будут приняты государством-участником;
10. описание стандартного режима деятельности по охране труда и обеспечению безопасности на объекте, выведенном из эксплуатации; и
11. заявление относительно того, будет ли объект переоборудован для уничтожения химического оружия, и если да, то даты такого переоборудования.

Объявления объектов по производству химического оружия согласно пункту 1 с) iii) статьи III

В объявлении объектов по производству химического оружия согласно пункту 1 с) iii) статьи III приводится вся информация, указанная в пункте 1 выше. Государство-участник, на территории которого находится или находился объект, несет ответственность за достижение соответствующих договоренностей с другим государством, с тем чтобы обеспечить представление объявлений. Если государство-участник, на территории которого находится или находился объект, не в состоянии выполнить это обязательство, то оно указывает соответствующие причины.

Объявления прошлых передач и получений

Государство-участник, передававшее или получавшее оборудование для производства химического оружия с 1 января 1946 года, объявляет эти передачи и получения согласно пункту 1 с) iv) статьи III и в соответствии с пунктом 5 ниже. В тех случаях, когда за период между 1 января 1946 года и 1 января 1970 года не имеется всей предусмотренной информации о передаче и получении такого оборудования, государство-участник объявляет любую имеющуюся у него информацию и представляет объяснение относительно того, почему оно не может представить полное объявление.
Оборудование для производства химического оружия, указанное в пункте 3, означает:
1. специализированное оборудование;
2. оборудование для производства оборудования, специально предназначенного для использования непосредственно в связи с применением химического оружия; и
3. оборудование, предназначенное или используемое исключительно для производства нехимических частей для химических боеприпасов.
В объявлении передачи и получения оборудования для производства химического оружия указывается:
1. кто получил/передал оборудование для производства химического оружия;
2. характер такого оборудования;
3. дата передачи или получения;
4. было ли уничтожено оборудование, если это известно; и
5. нынешнее местонахождение, если это известно.

Представление общих планов уничтожения

По каждому объекту по производству химического оружия государство-участник представляет следующую информацию:
1. планируемые сроки осуществления принимаемых мер; и
2. методы уничтожения.
По каждому объекту по производству химического оружия, который государство-участник намерено временно переоборудовать в объект по уничтожению химического оружия, государство-участник представляет следующую информацию:
1. планируемые сроки переоборудования в объект по уничтожению;
2. планируемые сроки использования объекта в качестве объекта по уничтожению химического оружия;
3. описание нового объекта;
4. метод уничтожения специального оборудования;
5. сроки уничтожения переоборудованного объекта после его использования для уничтожения химического оружия; и
6. метод уничтожения переоборудованного объекта.

Представление ежегодных планов уничтожения и ежегодных докладов об уничтожении

Государство-участник представляет ежегодный план уничтожения не менее чем за 90 дней до начала следующего года уничтожения. В ежегодном плане указывается следующее:
1. мощности, подлежащие уничтожению;
2. наименование и местоположение объектов, на которых будет осуществляться уничтожение;
3. перечень зданий и оборудования, которые будут уничтожены на каждом объекте; и
4. планируемый метод (методы) уничтожения.
Государство-участник представляет ежегодный доклад об уничтожении не позднее чем через 90 дней после окончания предыдущего года уничтожения. В ежегодном докладе указывается следующее:
1. уничтоженные мощности;
2. наименование и местоположение каждого объекта, на котором осуществлялось уничтожение;
3. перечень зданий и оборудования, которые были уничтожены на каждом объекте;
4. методы уничтожения.
В случае объекта по производству химического оружия, объявляемого согласно пункту 1 с) iii) статьи III, государство-участник, на территории которого находится или находился этот объект, несет ответственность за достижение соответствующих договоренностей, с тем чтобы обеспечить представление объявлений, указанных в пунктах 6-9 выше. Если государство-участник, на территории которого находится или находился объект, не в состоянии выполнить это обязательство, то оно указывает соответствующие причины.

B.

УНИЧТОЖЕНИЕ

Общие принципы уничтожения объектов по производству химического оружия

Каждое государство-участник определяет методы, которые должны применяться для уничтожения объектов по производству химического оружия, в соответствии с принципами, изложенными в статье V и в настоящей части.

Принципы и методы закрытия объекта по производству химического оружия

Цель закрытия объекта по производству химического оружия состоит в том, чтобы вывести его из эксплуатации.

Согласованные меры по закрытию принимаются государством-участником с должным учетом конкретных особенностей каждого объекта. Такие меры включают, среди прочего:
1. запрещение занятия специализированных зданий и стандартных зданий объекта, кроме как для согласованных видов деятельности;
2. отключение оборудования, непосредственно связанного с производством химического оружия, включая, среди прочего, контрольно-технологическое оборудование и коммуникации;
3. вывод из эксплуатации защитных установок и оборудования, используемых исключительно для обеспечения безопасной эксплуатации объекта по производству химического оружия;
4. установку заглушек и других устройств для предотвращения добавки химикатов в любое специализированное технологическое оборудование для синтеза, выделения или очистки химикатов, определенных как химическое оружие, в любую емкость для хранения или в любой механизм для снаряжения химического оружия, либо для предотвращения извлечения из них таких химикатов, а также для предотвращения теплоснабжения, охлаждения или электро- и другого энергоснабжения такого оборудования, емкостей для хранения или механизмов; и
5. блокирование железнодорожных, автомобильных и других подъездных путей для доступа тяжелого транспорта к объекту по производству химического оружия, за исключением тех из них, которые требуются для согласованных видов деятельности.

Пока объект по производству химического оружия остается закрытым, государство-участник может продолжать на объекте деятельность по обеспечению безопасности и физической защиты.

Техническое обслуживание объектов по производству химического оружия до их уничтожения

Государство-участник может осуществлять на объектах по производству химического оружия стандартную деятельность по обслуживанию исключительно по соображениям безопасности, включая визуальные обследования, профилактическое обслуживание и текущий ремонт.

Вся запланированная деятельность по обслуживанию оговаривается в общем и детальном планах уничтожения. Деятельность по обслуживанию не включает:
1. замену любого технологического оборудования;
2. изменение характеристик химико-технологического оборудования;
3. производство химикатов любого типа.
Вся деятельность по обслуживанию подлежит наблюдению со стороны Технического секретариата.

Принципы и методы временного переоборудования объектов по производству химического оружия в объекты по уничтожению химического оружия

Меры, касающиеся временного переоборудования объектов по производству химического оружия в объекты по уничтожению химического оружия, обеспечивают, чтобы режим для временно переоборудованных объектов был, по крайней мере, таким же строгим, как и режим для непереоборудованных объектов по производству химического оружия.
Объекты по производству химического оружия, переоборудованные в объекты по уничтожению химического оружия до вступления в силу настоящей Конвенции, объявляются по категории объектов по производству химического оружия. Они подлежат первоначальному посещению инспекторами, которые подтверждают правильность информации относительно этих объектов. Требуется также проверка того, что переоборудование этих объектов было осуществлено таким образом, чтобы привести их в нерабочее состояние в качестве объектов по производству химического оружия, причем такая проверка осуществляется в рамках мер, предусмотренных для объектов, которые должны быть приведены в нерабочее состояние не позднее чем через 90 дней после вступления в силу настоящей Конвенции.
Государство-участник, которое намерено произвести переоборудование объектов по производству химического оружия, представляет Техническому секретариату, не позднее чем через 30 дней после вступления для него в силу настоящей Конвенции или не позднее чем через 30 дней после принятия решения о временном переоборудовании, общий план переоборудования объекта, а впоследствии представляет ежегодные планы.
Если государство-участник испытывает необходимость переоборудовать в объект по уничтожению химического оружия еще один объект по производству химического оружия, который был закрыт после вступления для него в силу настоящей Конвенции, оно информирует об этом Технический секретариат не менее чем за 150 дней до переоборудования. Технический секретариат совместно с государством-участником удостоверяется в принятии необходимых мер к тому, чтобы после переоборудования объект был приведен в нерабочее состояние в качестве объекта по производству химического оружия.
Объект, переоборудованный для уничтожения химического оружия, не должен быть в большей степени пригоден для возобновления производства химического оружия, чем объект по производству химического оружия, который был закрыт и находится на обслуживании. Для возобновления его деятельности должно требоваться не меньше времени, чем в случае закрытого и находящегося на обслуживании объекта по производству химического оружия.
Переоборудованные объекты по производству химического оружия уничтожаются не позднее чем через 10 лет после вступления в силу настоящей Конвенции.
Любые меры по переоборудованию любого данного объекта по производству химического оружия увязываются с конкретным объектом и зависят от его индивидуальных особенностей.
Комплекс мер, осуществляемых с целью переоборудования объекта по производству химического оружия в объект по уничтожению химического оружия, является не менее широким, чем комплекс мер, предусмотренных для вывода из эксплуатации других объектов по производству химического оружия, которые подлежат осуществлению не позднее чем через 90 дней после вступления в силу настоящей Конвенции для государства-участника.

Принципы и методы, касающиеся уничтожения объекта по производству химического оружия

Государство-участник уничтожает оборудование и здания, охватываемые определением объекта по производству химического оружия, следующим образом:
1. все специализированное оборудование и стандартное оборудование подвергается физическому уничтожению;
2. все специализированные здания и стандартные здания подвергаются физическому уничтожению.
Государство-участник уничтожает объекты по производству неснаряженных химических боеприпасов и оборудования для применения химического оружия следующим образом:
1. объекты, используемые исключительно для производства нехимических частей для химических боеприпасов или оборудования, специально предназначенного для использования непосредственно в связи с применением химического оружия, объявляются и уничтожаются. Процесс уничтожения и его проверка осуществляются в соответствии с положениями статьи V и данной части настоящего Приложения, которые регулируют уничтожение объектов по производству химического оружия;
2. все оборудование, предназначенное или используемое исключительно для производства нехимических частей для химических боеприпасов, подвергается физическому уничтожению. Такое оборудование, которое включает специально сконструированные мульды и металлообразующие пресс-формы, может быть доставлено в специальное место для уничтожения;
3. все здания и стандартное оборудование, использовавшиеся для такой производственной деятельности, уничтожаются или переоборудуются для не запрещаемых по настоящей Конвенции целей с подтверждением, в случае необходимости, путем консультаций и инспекций, как это предусмотрено в статье IХ;
4. деятельность в целях, не запрещаемых по настоящей Конвенции, может продолжаться в ходе уничтожения или переоборудования.

Порядок уничтожения

В основе порядка уничтожения объектов по производству химического оружия лежат обязательства, изложенные в статье I и в других статьях настоящей Конвенции, включая обязательства, касающиеся систематической проверки на месте. Он учитывает заинтересованность государств-участников в неуменьшении безопасности в период уничтожения; укреплении доверия на начальном этапе стадии уничтожения; постепенном накоплении опыта в ходе уничтожения объектов по производству химического оружия и применимости независимо от фактических характеристик объектов и избранных методов их уничтожения. В основе порядка уничтожения лежит принцип выравнивания.
Для каждого периода уничтожения государство-участник определяет, какие объекты по производству химического оружия подлежат уничтожению, и осуществляет уничтожение таким образом, чтобы к концу каждого периода уничтожения остаток составлял не более того, что указано в пунктах 30 и 31. Государству-участнику не воспрещается уничтожать свои объекты более быстрыми темпами.
К объектам по производству химического оружия, которые производят химикаты Списка 1, применяются следующие положения:
1. государство-участник начинает уничтожение таких объектов не позднее чем через один год после вступления для него в силу настоящей Конвенции и завершает его не позднее чем через 10 лет после вступления в силу настоящей Конвенции. Для государства, которое является участником при вступлении в силу настоящей Конвенции, этот общий период подразделяется на три отдельных периода уничтожения, а именно: 2-5 лет, 6-8 лет и 9-10 лет. Для государств, которые становятся участниками после вступления в силу настоящей Конвенции, периоды уничтожения корректируются с учетом пунктов 28 и 29;
2. в качестве фактора сопоставления для таких объектов используется производственная мощность. Она выражается в тоннах отравляющего вещества, с учетом правил, установленных для бинарного химического оружия;
3. на конец восьмого года после вступления в силу настоящей Конвенции устанавливаются соответствующие согласованные уровни производственной мощности. Производственные мощности, которые превышают соответствующий уровень, уничтожаются равными прирастающими количествами в течение первых двух периодов уничтожения;
4. требование в отношении уничтожения данного объема мощностей влечет за собой требование в отношении уничтожения любого другого объекта по производству химического оружия, который осуществлял поставки для объекта Списка 1 или снаряжал боеприпасы или устройства произведенным на нем химикатом Списка 1;
5. объекты по производству химического оружия, которые были временно переоборудованы для уничтожения химического оружия, по-прежнему подпадают под обязательство об уничтожении мощностей в соответствии с положениями данного пункта.
Государство-участник начинает уничтожение объектов по производству химического оружия, не охваченных пунктом 30, не позднее чем через один год после вступления для него в силу настоящей Конвенции и завершает его не позднее чем через пять лет после вступления в силу настоящей Конвенции.

Подробные планы уничтожения

Не менее чем за 180 дней до начала уничтожения объекта по производству химического оружия государство-участник представляет Техническому секретариату подробные планы уничтожения объекта, включая предлагаемые меры проверки уничтожения, упомянутые в пункте 33 f), в отношении, среди прочего, следующего:
1. сроков присутствия инспекторов на объекте, подлежащем уничтожению; и
2. процедур проверки мер, применимых к каждому предмету в объявленном инвентарном перечне.
Подробные планы уничтожения каждого объекта по производству химического оружия включают:
1. детальный график процесса уничтожения;
2. план объекта;
3. технологическую блок-схему;
4. подробный инвентарный перечень оборудования, зданий и других предметов, подлежащих уничтожению;
5. меры, которые должны применяться к каждому предмету в этом инвентарном перечне;
6. предлагаемые меры проверки;
7. меры безопасности/предосторожности, которые должны соблюдаться при уничтожении объекта; и
8. рабочие и жилищно-бытовые условия, подлежащие предоставлению инспекторам.
Если государство-участник намерено осуществить временное переоборудование объекта по производству химического оружия в объект по уничтожению химического оружия, оно уведомляет Технический секретариат не менее чем за 150 дней до осуществления любой деятельности по переоборудованию. В уведомлении:
1. указывается наименование, адрес и местоположение объекта;
2. представляется план места с указанием всех сооружений и участков, которые будут использованы при уничтожении химического оружия, а также отмечаются все сооружения объекта по производству химического оружия, которые подлежат временному переоборудованию;
3. указываются подлежащие уничтожению виды химического оружия и вид и количество химического снаряжения;
4. указывается метод уничтожения;
5. представляется технологическая блок-схема с указанием тех элементов производственного процесса и специализированного оборудования, которые будут переоборудованы для уничтожения химического оружия;
6. в соответствующих случаях указываются пломбы и инспекционное оборудование, потенциально затрагиваемые переоборудованием; и
7. представляется график с указанием: времени, отводимого на проектирование, временное переоборудование объекта, монтаж оборудования, проверку оборудования, операции по уничтожению и закрытие.
В связи с уничтожением объекта, который был временно переоборудован для уничтожения химического оружия, представляется информация в соответствии с пунктами 32 и 33.

Рассмотрение подробных планов

На основе подробного плана уничтожения и предлагаемых мер проверки, представленных государством-участником, а также исходя из опыта предыдущих инспекций Технический секретариат готовит план проверки уничтожения объекта в тесной консультации с государством-участником. Любые разногласия между Техническим секретариатом и государством-участником относительно соответствующих мер должны урегулироваться посредством консультаций. Любые нерешенные вопросы передаются Исполнительному совету для принятия соответствующих мер в целях содействия полному осуществлению настоящей Конвенции.
С тем чтобы обеспечить выполнение положений статьи V и настоящей части, Исполнительный совет и государство-участник согласуют сводные планы уничтожения и проверки. Такое согласование должно быть завершено не менее чем за 60 дней до планируемого начала уничтожения.
Каждый член Исполнительного совета может консультироваться с Техническим секретариатом по любым вопросам, касающимся адекватности сводного плана уничтожения и проверки. При отсутствии возражений со стороны любого члена Исполнительного совета этот план приводится в действие.
При наличии любых трудностей Исполнительный совет вступает в консультации с государством-участником для их разрешения. Если любые трудности остаются непреодоленными, они передаются Конференции. Урегулирование любых разногласий относительно методов уничтожения не задерживает осуществление других частей плана уничтожения, которые являются приемлемыми.
В том случае, если не удается достичь согласия с Исполнительным советом по аспектам проверки или в случае невозможности ввести в действие одобренный план проверки, проверка уничтожения осуществляется посредством непрерывного наблюдения при помощи приборов, устанавливаемых на месте, и физического присутствия инспекторов.
Уничтожение и проверка осуществляются в соответствии с согласованным планом. Проверка не создает ненужных помех для процесса уничтожения и осуществляется посредством присутствия инспекторов на месте для засвидетельствования уничтожения.
Если требуемые мероприятия по проверке или уничтожению не осуществляются в соответствии с планом, то об этом информируются все государства-участники.

C. ПРОВЕРКА

Проверка объявлений объектов по производству химического оружия посредством инспекции на месте

Технический секретариат проводит первоначальную инспекцию каждого объекта по производству химического оружия в период между 90 и 120 днями после вступления в силу настоящей Конвенции для государства-участника.
Цели первоначальной инспекции состоят в следующем:
1. подтвердить, что производство химического оружия прекращено и что объект выведен из эксплуатации в соответствии с настоящей Конвенцией;
2. позволить Техническому секретариату ознакомиться с принятыми мерами по прекращению производства химического оружия на объекте;
3. позволить инспекторам установить временные пломбы;
4. позволить инспекторам подтвердить инвентарный перечень зданий и специализированного оборудования;
5. получить информацию, необходимую для планирования инспекционной деятельности на объекте, включая использование пломб, указывающих на несанкционированное вмешательство, и другого согласованного оборудования, которое устанавливается согласно подробному соглашению по объекту для данного объекта; и
6. провести предварительные обсуждения относительно подробного соглашения о процедурах инспекции на объекте.
Для облегчения точности инвентаризации объявленных предметов на каждом объекте по производству химического оружия инспекторы используют соответственно согласованные пломбы, маркировку или другие процедуры инвентарного контроля.
Инспекторы устанавливают такие согласованные устройства, которые могут потребоваться для обнаружения любого возобновления производства химического оружия или удаления любого объявленного предмета. Они принимают необходимые меры предосторожности, с тем чтобы не препятствовать деятельности по закрытию, осуществляемой инспектируемым государством-участником. Инспекторы могут возвращаться для обслуживания и проверки целостности таких устройств.
Если на основе первоначальной инспекции Генеральный директор считает, что для вывода объекта из эксплуатации в соответствии с настоящей Конвенцией необходимы дополнительные меры, то Генеральный директор, не позднее чем через 135 дней после вступления в силу настоящей Конвенции для государства-участника, может просить об осуществлении таких мер инспектируемым государством-участником не позднее чем через 180 дней после вступления для него в силу настоящей Конвенции. По своему усмотрению инспектируемое государство-участник может удовлетворить эту просьбу. Если оно не удовлетворяет просьбу, то инспектируемое государство-участник и Генеральный директор проводят консультации в целях урегулирования данного вопроса.

Систематическая проверка объектов по производству химического оружия и прекращения их деятельности

Цель систематической проверки объекта по производству химического оружия заключается в том, чтобы обеспечить обнаружение любого возобновления производства химического оружия или удаления объявленных предметов на данном объекте.
В подробном соглашении по объекту для каждого объекта по производству химического оружия указываются:
1. подробные процедуры инспекции на месте, которые могут включать:
  1. визуальные осмотры;
  2. проверку и обслуживание пломб и других согласованных устройств; и
  3. отбор и анализ проб;
2. процедуры использования пломб, указывающих на несанкционированное вмешательство, и другого согласованного оборудования для предотвращения необнаруженного возобновления эксплуатации объекта с указанием:
  1. типа, места и процедур установки; и
  2. мероприятий по обслуживанию таких пломб и оборудования; и
3. другие согласованные меры
Пломбы или другое утвержденное оборудование, предусмотренное в подробном соглашении о мерах по проведению инспекции для данного объекта, устанавливаются не позднее чем через 240 дней после вступления в силу настоящей Конвенции для государства-участника. Инспекторам разрешается посещать каждый объект по производству химического оружия для установки таких пломб или оборудования.
В течение каждого календарного года Техническому секретариату разрешается проводить до четырех инспекций каждого объекта по производству химического оружия.
Генеральный директор уведомляет инспектируемое государство-участник о своем решении провести инспекцию или посещение объекта по производству химического оружия за 48 часов до планируемого прибытия инспекционной группы на объект для систематических инспекций или посещений. В случае проведения инспекций или посещений для урегулирования неотложных проблем этот период может быть сокращен. Генеральный директор указывает цель инспекции или посещения.
Инспекторы в соответствии с соглашениями по объекту имеют беспрепятственный доступ ко всем частям объектов по производству химического оружия. Подлежащие инспекции предметы объявленного инвентарного перечня выбираются инспекторами.
Основные принципы для определения частоты систематических инспекций на месте рассматриваются и утверждаются Конференцией согласно пункту 21 i) статьи VIII. Подлежащий инспекции конкретный производственный объект выбирается Техническим секретариатом таким образом, чтобы исключить возможность точного определения времени инспекции объекта.

Проверка уничтожения объектов по производству химического оружия

Цель систематической проверки уничтожения объектов по производству химического оружия заключается в подтверждении того, что объект уничтожен в соответствии с обязательствами по настоящей Конвенции и что каждый предмет объявленного инвентарного перечня уничтожен в соответствии с согласованным подробным планом уничтожения.
По уничтожении всех предметов объявленного инвентарного перечня Технический секретариат подтверждает соответствующее объявление государства-участника. После такого подтверждения Технический секретариат прекращает систематическую проверку объекта по производству химического оружия и немедленно снимает все устройства и контрольные приборы, установленные инспекторами.
После этого подтверждения государство-участник делает объявление о том, что объект уничтожен.

Проверка временного переоборудования объекта по производству xимического оружия в объект по уничтожению химического оружия

Не позднее чем через 90 дней после получения первоначального уведомления о намерении осуществить временное переоборудование производственного объекта инспекторы имеют право посетить объект для ознакомления с намечаемым временным переоборудованием и изучения возможных инспекционных мер, которые потребуются в ходе переоборудования.
Не позднее чем через 60 дней после такого посещения Технический секретариат и инспектируемое государство-участник заключают переходное соглашение, предусматривающее дополнительные инспекционные меры на период временного переоборудования. В переходном соглашении оговариваются инспекционные процедуры, включая использование пломб, контрольного оборудования и инспекций, которые обеспечат уверенность в том, что в процессе переоборудования не осуществляется производство химического оружия. Это соглашение остается в силе с начала деятельности по временному переоборудованию до начала функционирования объекта в качестве объекта по уничтожению химического оружия.
До заключения переходного соглашения инспектируемое государство-участник не осуществляет удаления или переоборудования любой части объекта, а также не снимает и не изменяет любых пломб или другого согласованного инспекционного оборудования, которое может быть установлено согласно настоящей Конвенции.
С началом функционирования объекта в качестве объекта по уничтожению химического оружия, он охватывается положениями части IV A) настоящего Приложения, применимыми к объектам по уничтожению химического оружия. Мероприятия на предэксплуатационный период регулируются переходным соглашением.
В ходе операций по уничтожению инспекторы имеют доступ ко всем частям временно переоборудованных объектов по производству химического оружия, включая те из них, которые не имеют прямого отношения к уничтожению химического оружия.
До начала работ на объекте по его временному переоборудованию в целях уничтожения химического оружия и после прекращения функционирования объекта в качестве объекта по уничтожению химического оружия этот объект охватывается положениями настоящей части, применимыми к объектам по производству химического оружия.

D. КОНВЕРСИЯ ОБЪЕКТОВ ПО ПРОИЗВОДСТВУ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ НА ЦЕЛИ, НЕ ЗАПРЕЩАЕМЫЕ ПО НАСТОЯЩЕЙ КОНВЕНЦИИ

Процедуры подачи заявки на конверсию

Заявка на использование объекта по производству химического оружия в целях, не запрещаемых по настоящей Конвенции, может подаваться в отношении любого объекта, который государство-участник уже использует в таких целях до вступления для него в силу настоящей Конвенции или который оно планирует использовать в таких целях.
В отношении объекта по производству химического оружия, который используется в целях, не запрещаемых по настоящей Конвенции, во время вступления в силу настоящей Конвенции для государства-участника, заявка представляется Генеральному директору не позднее чем через 30 дней после вступления в силу настоящей Конвенции для государства-участника. В дополнение к данным, представляемым в соответствии с пунктом 1 h) iii), заявка содержит следующую информацию:
1. подробное обоснование заявки;
2. общий план конверсии объекта с указанием следующего:
  1. характер деятельности, которая будет осуществляться на объекте;
  2. если планируемая деятельность связана с производством, переработкой или потреблением химикатов: наименование каждого химиката, блок-схема объекта и количества, планируемые к производству, переработке или потреблению ежегодно;
  3. какие здания или сооружения намечается использовать и какие намечаются модификации, если таковые будут иметь место;
  4. какие здания или сооружения уничтожены или намечаются к уничтожению и планы уничтожения;
  5. какое оборудование будет использоваться на объекте;
  6. какое оборудование удалено и уничтожено и какое оборудование намечается удалить и уничтожить и планы его уничтожения;
  7. намечаемый график конверсии, если это применимо; и
  8. характер деятельности каждого другого объекта, функционирующего на месте; и
3. подробное объяснение, каким образом меры, изложенные в подпункте b), а также любые другие меры, намечаемые государством-участником, обеспечат недопущение наличия на объекте резервного потенциала по производству химического оружия.
Для объекта по производству химического оружия, который не используется в целях, не запрещаемых по настоящей Конвенции, во время вступления в силу настоящей Конвенции для государства-участника, заявка представляется Генеральному директору не позднее чем через 30 дней после принятия решения о конверсии, но ни в коем случае не позднее чем через четыре года после вступления в силу настоящей Конвенции для государства-участника. Заявка содержит следующую информацию:
1. подробное обоснование заявки, включая ее экономические потребности;
2. общий план конверсии объекта с указанием следующего:
  1. характер деятельности, планируемой к осуществлению на объекте;
  2. если планируемая деятельность связана с производством, переработкой или потреблением химикатов: наименование каждого химиката, блок-схема объекта и количества, планируемые к производству, переработке или потреблению ежегодно;
  3. какие здания или сооружения намечается сохранить и какие намечаются модификации, если таковые будут иметь место;
  4. какие здания или сооружения уничтожены или намечаются к уничтожению и планы уничтожения;
  5. какое оборудование намечается к использованию на объекте;
  6. какое оборудование намечается удалить и уничтожить и планы его уничтожения;
  7. намечаемый график конверсии; и
  8. характер деятельности каждого другого объекта, функционирующего на месте; и
3. подробное объяснение, каким образом меры, изложенные в подпункте b), а также любые другие меры, намечаемые государством-участником, обеспечат недопущение наличия на объекте резервного потенциала по производству химического оружия.
Государство-участник может предложить в своей заявке любые другие меры, которые оно считает целесообразными для укрепления доверия.

Действия до принятия решения

До решения Конференции государство-участник может продолжать использовать в целях, не запрещаемых по настоящей Конвенции, объект, который используется в таких целях до вступления для него в силу настоящей Конвенции, но только в том случае, если в своей заявке государство-участник удостоверяет, что никакое специализированное оборудование и никакие специализированные здания не используются и что специализированное оборудование и специализированные здания приведены в нерабочее состояние с использованием методов, указанных в пункте 13.
Если объект, в связи с которым подается заявка, не используется в целях, не запрещаемых по настоящей Конвенции, до вступления в силу настоящей Конвенции для государства-участника или если не производится удостоверения, требуемого в пункте 68, то государство-участник немедленно прекращает всю деятельность согласно пункту 4 статьи V. Государство-участник закрывает объект в соответствии с пунктом 13 не позднее чем через 90 дней после вступления для него в силу настоящей Конвенции.

Условия конверсии

В качестве условия конверсии объекта по производству химического оружия в целях, не запрещаемых по настоящей Конвенции, все специализированное оборудование на объекте должно быть уничтожено и все специальные элементы зданий и сооружений, которые отличают их от зданий и сооружений, обычно используемых в целях, не запрещаемых по настоящей Конвенции, и не связанных с химикатами Списка 1, должны быть устранены.
Конверсированный объект не используется:
1. для любой деятельности, связанной с производством, переработкой или потреблением химиката Списка 1 или химиката Списка 2; или
2. для производства любого высокотоксичного химиката, включая любой высокотоксичный органофосфорный химикат, или для любой иной деятельности, которая требовала бы специального оборудования для работы с высокотоксичными или высококоррозионными химикатами, если Исполнительный совет не решит, что такое производство или деятельность не будут связаны с риском для предмета или цели настоящей Конвенции, с учетом критериев токсичности, коррозионности и, в соответствующих случаях, других технических факторов, подлежащих рассмотрению и утверждению Конференцией согласно пункту 21 i) статьи VIII.
Конверсия объекта по производству химического оружия завершается не позднее чем через шесть лет после вступления в силу настоящей Конвенции.
72bis.Если государство ратифицирует настоящую Конвенцию или присоединяется к ней после истечения шестилетнего периода, предусмотренного для конверсии в пункте 72, Совет на своей второй последующей очередной сессии устанавливает срок представления любой заявки на конверсию объекта по производству химического оружия в целях, не запрещаемых по настоящей Конвенции. В решении Конференции об одобрении такой заявки согласно пункту 75 устанавливается наиболее ранний практически возможный срок завершения конверсии. Конверсия завершается как можно скорее, но в любом случае не позднее чем через шесть лет после вступления в силу Конвенции для государства-участника. С учетом изменений, предусмотренных в настоящем пункте, применяются все положения раздела D данной части настоящего Приложения.

Решения Исполнительного совета и Конференции

Не позднее чем через 90 дней после получения заявки Генеральным директором Технический секретариат проводит первоначальную инспекцию объекта. Цель этой инспекции состоит в том, чтобы определить точность представленной в заявке информации, получить информацию о технических характеристиках намечаемого к конверсии объекта и оценить условия, на которых может быть разрешено его использование в целях, не запрещаемых по настоящей Конвенции. Генеральный директор незамедлительно представляет Исполнительному совету, Конференции и всем государствам-участникам доклад, содержащий его рекомендации в отношении мер, необходимых для того, чтобы произвести конверсию объекта в целях, не запрещаемых по настоящей Конвенции, и обеспечить уверенность в том, что конверсированный объект будет использоваться исключительно в целях, не запрещаемых по настоящей Конвенции.
Если объект использовался в целях, не запрещаемых по настоящей Конвенции, до вступления в силу настоящей Конвенции для государства-участника, и продолжает эксплуатироваться, а меры, подлежащие удостоверению согласно пункту 68, не были приняты, то Генеральный директор немедленно информирует Исполнительный совет, который может потребовать осуществления мер, какие он сочтет целесообразными, включая, среди прочего, остановку объекта и удаление специализированного оборудования и модифицирование зданий или сооружений. Исполнительный совет устанавливает срок осуществления этих мер и до их удовлетворительного осуществления приостанавливает рассмотрение заявки. По истечении этого срока объект безотлагательно подвергается инспекции, с тем чтобы установить, осуществлены ли эти меры. Если эти меры не осуществлены, то государству-участнику предписывается полностью прекратить всю деятельность на объекте.
Как можно скорее после получения доклада Генерального директора Конференция по рекомендации Исполнительного совета, с учетом доклада и любых мнений, высказанных государствами-участниками, решает вопрос об одобрении заявки и устанавливает условия, на которых дается такое одобрение. Если любое государство-участник возражает против одобрения заявки и соответствующих условий, то между заинтересованными государствами-участниками в течение не более 90 дней проводятся консультации с целью нахождения взаимоприемлемого решения. Решение в связи с заявкой и соответствующими условиями, а также в связи с любыми предлагаемыми к ним коррективами принимается как по вопросу существа как можно скорее после истечения периода консультаций.
Если заявка одобряется, то не позднее чем через 90 дней после принятия такого решения составляется соглашение по объекту. Соглашение по объекту содержит условия, на которых разрешается конверсия и использование объекта, включая меры проверки. До заключения соглашения по объекту конверсия не начинается.

Подробные планы конверсии

Не менее чем за 180 дней до планируемого начала конверсии объекта по производству химического оружия государство-участник представляет Техническому секретариату подробные планы конверсии объекта, включая предлагаемые меры для проверки конверсии, в отношении, среди прочего, следующего:
1. сроков присутствия инспекторов на объекте, подлежащем конверсии; и
2. процедур проверки мер, подлежащих осуществлению в отношении каждого предмета в объявленном инвентарном перечне.
Подробный план конверсии каждого объекта по производству химического оружия содержит:
1. подробный график процесса конверсии;
2. план объекта до и после конверсии;
3. технологическую блок-схему объекта до и, если это применимо, после конверсии;
4. подробный инвентарный перечень оборудования, зданий и сооружений и других предметов, подлежащих уничтожению, и зданий и сооружений, подлежащих модифицированию;
5. меры, подлежащие осуществлению в отношении каждого предмета в инвентарном перечне, если таковые имеют место;
6. предлагаемые меры проверки;
7. меры защиты/безопасности, подлежащие соблюдению в ходе конверсии объекта; и
8. рабочие и жилищно-бытовые условия, подлежащие предоставлению инспекторам.

Рассмотрение подробных планов

На основе подробного плана конверсии и предлагаемых мер проверки, представляемых государством-участником, а также исходя из опыта предыдущих инспекций Технический секретариат в тесных консультациях с государством-участником готовит план проверки конверсии объекта. Любые разногласия между Техническим секретариатом и государством-участником относительно соответствующих мер урегулируются посредством консультаций. Любые неурегулированные вопросы передаются Исполнительному совету для принятия соответствующих мер с целью облегчить полное осуществление настоящей Конвенции.
С тем чтобы обеспечить выполнение положений статьи V и настоящей части, сводные планы конверсии и проверки согласуются между Исполнительным советом и государством-участником. Это согласование завершается не менее чем за 60 дней до планируемого начала конверсии.
Каждый член Исполнительного совета может консультироваться с Техническим секретариатом по любому вопросу, касающемуся адекватности сводного плана конверсии и проверки. В отсутствие возражений со стороны любого члена Исполнительного совета план приводится в действие.
При возникновении любых трудностей Исполнительный совет должен вступать в консультации с государством-участником с целью их устранения. Если какие-либо трудности останутся непреодоленными, то они должны передаваться Конференции. Урегулирование любых разногласий относительно методов конверсии не должно затягивать осуществление других разделов плана конверсии, которые являются приемлемыми.
Если не удается достичь согласия с Исполнительным советом по аспектам проверки или если одобренный план проверки не может быть приведен в действие, проверка конверсии осуществляется посредством непрерывного наблюдения при помощи приборов, устанавливаемых на месте, и физического присутствия инспекторов.
Конверсия и проверка осуществляются в соответствии с согласованным планом. Проверка не создает необоснованных помех для процесса конверсии и проводится посредством присутствия инспекторов для подтверждения конверсии.
В течение 10 лет после того, как Генеральный директор удостоверит завершение конверсии, государство-участник в любое время предоставляет инспекторам беспрепятственный доступ на объект. Инспекторы имеют право осуществлять наблюдение всех участков, всех видов деятельности и всех предметов оборудования на объекте. Инспекторы имеют право проверять соответствие деятельности на объекте любым условиям, установленным в соответствии с настоящим разделом Исполнительным советом и Конференцией. Инспекторы также имеют право в соответствии с положениями раздела Е части II настоящего Приложения получать пробы с любого участка объекта и подвергать их анализу для проверки отсутствия химикатов Списка 1, их стабильных побочных продуктов и продуктов распада, а также химикатов Списка 2 и для проверки соответствия деятельности на объекте любым другим условиям в отношении химической деятельности, установленным в соответствии с настоящим разделом Исполнительным советом и Конференцией. Инспекторы также имеют право на регулируемый доступ в соответствии с разделом С части Х настоящего Приложения к производственной зоне, в которой расположен объект. В течение 10-летнего периода государство-участник ежегодно представляет доклад о деятельности на конверсированном объекте. По завершении 10 летнего периода Исполнительный совет, с учетом рекомендаций Технического секретариата, принимает решение о характере дальнейших мер проверки.
Расходы по проверке конверсированного объекта распределяются в соответствии с пунктом 19 статьи V.

Завод по производству соков | Бизнес план » ДеньгоДел

Фруктовые, ягодные, овощные соки – это напитки, которые пользуются огромной популярностью, особенно в жаркое время года.

Организовать соковое производство не так уж и сложно, если учесть все необходимые нюансы – правильно подобрать оборудование для производства соков (какое необходимо и сколько оно стоит мы расскажем далее), закупить качественное сырье, тару и грамотно организовать весь процесс производства.

Бизнес-план производства соков

В каждом бизнесе важно грамотно составить бизнес-план, учтя все особенности конкретно вашего случая. У нас вы можете скачать пример бизнес-плана производства соков. Скачать бизнес-план производства соков

Как начать бизнес по производству соков

Регистрация компании

Существует несколько организационных форм, в которых начинающий предприниматель может зарегистрировать свою компанию. Такой бизнес, как завод по производству соков, лучше всего регистрировать в форме общества с ограниченной ответственностью. Так вы значительно упростите своему бизнесу систему распределения долей ответственности каждого из соучредителей. На первых порах, когда доход еще не будет высоким, лучше использовать упрощенную систему налогообложения.

Если вы решили заняться производством соков, то вам необходимо тщательно изучить законодательные акты, которые регулируют эту сферу деятельности. Речь идет о таких документах, как «О защите прав потребителей», «О качестве пищевых продуктов», санитарно-эпидемиологические акты и другие.

Помещение

Даже небольшое производство соков требует довольно вместительного помещения, в котором будет размещаться оборудование, а также запасы сырья. Сырье необходимо хранить в одном помещении, а уже готовую продукцию – в другом. Также нужно предусмотреть помещение под офис. В принципе, офис может находиться и за пределами самого завода, однако лучше, если он будет располагаться в максимальной близости к производству. Выбирая помещение, где будут размещаться производственное оборудование, необходимо опираться на существующие санитарно-эпидемиологические и пожарные нормы.

Если размещение точек продажи готовой продукции необходимо тщательно продумывать, чтобы получить максимальную прибыль, то разместить само производство можно практически где угодно. Расположив завод за городом, вы сэкономите на коммунальных услугах и аренде помещения. Оптимальный размер небольшого завода по производству соков – 150 квадратных метров.

Оборудование

Комплекты оборудования для производства соков стоят в пределах 60-200 тысяч долларов. Линия конвейера состоит из такого оборудования:

Фильтр для очистки воды;
Фильтр для очистки сырья;
Емкости для хранения и смешивания добавок;
Гомогенизатор;
Теплообменник;
Пастеризатор;
Устройство разлива готовой продукции в упаковки;
Приспособление для промыва;
Оборудование для запечатывания соков в тару.

Сырье

Для изготовления сока понадобиться такое сырье, как вода, соковый концентрат, сахар и различные добавки (минералы, витамины). Концентрат соков обычно закупают в Китае, Бразилии или Турции. Не стоит ограничиваться лишь производством восстановленных соков, можно изготавливать также и нектары, сокосодержащие напитки. Они отличаются от восстановленных соков разным процентов содержания в них концентрата.

Технология производства соков

Процесс изготовления восстановленного сока состоит из следующих стадий.

Концентрированный сок нужно нагреть примерно до 100 градусов по Цельсию, и сделать это очень быстро – за 30 секунд. Нагретый концентрат продержать таким около 4 секунд, затем обратно охладить до комнатной температуры. Далее следует этап добавления в получившуюся жидкость отфильтрованной воды, количество которой зависит от того, сколько было ранее выпарено воды из концентрата. Затем добавляются минералы и витамины (если необходимо).

На выходе мы имеем сок, который имеем практически то же содержание полезных веществ, что и свежевыжатый сок.

Упаковка и тара

В качестве тары для соков можно использовать и традиционное стекло, и упаковку Tetra Pak. Однако, второй вариант является более выгодным с точки зрения как удобства, так и экономии. Стеклянные бутылки труднее безопасно транспортировать, к тому же стекло пропускает солнечный свет, а это может негативно отразиться на свойствах напитка.

Определение производства Merriam-Webster

производство | \ prə-ˈdək-shən , прō- \

б (1) : литературное или художественное произведение

(2) : произведение, представленное публике (на сцене, на экране или в эфире).

c : нечто преувеличенное, непропорционально важности

б : создание утилиты особенно : предоставление товаров в пользование

3 : общий объем производства, особенно товара или отрасли

4 часто атрибутивный : то, что специально не разработано или не настроено и обычно производится серийно. корпус для производства серийных автомобилей

Как это сделать? — Введение в бизнес

Какие типы производственных процессов используют производители и обслуживающие компании?

При планировании производства первое решение связано с тем, какой тип производственного процесса — способ создания товара или услуги — лучше всего соответствует целям компании и потребительскому спросу.Важным фактором является тип производимого товара или услуги, поскольку для разных товаров могут потребоваться разные производственные процессы. В общем, существует три типа производства: массовое производство, массовая настройка и настройка. Помимо производственного типа, операционные менеджеры также классифицируют производственные процессы двумя способами: (1) как входы преобразуются в выходы и (2) по времени процесса.

Один для всех: массовое производство

Массовое производство, в котором одновременно производится множество идентичных товаров, было продуктом промышленной революции.Автомобиль Генри Форда Model-T — хороший пример раннего массового производства. Каждая машина, выпущенная заводом Форда, была идентична вплоть до цвета. Если вы хотели машину любого цвета, кроме черного, вам не повезло. Консервы, лекарства, отпускаемые без рецепта, и бытовая техника — другие примеры товаров, которые производятся массово. Акцент в массовом производстве делается на поддержании низких производственных затрат за счет производства однородных продуктов с использованием повторяющихся и стандартизованных процессов. По мере того, как производство продукции становилось все более сложным, массовое производство также становилось более сложным.Например, производители автомобилей теперь должны включать в конструкцию своих автомобилей более сложную электронику. В результате количество сборочных станций на большинстве автомобильных заводов увеличилось.

Только для вас: настройка товаров

При массовой настройке товары производятся с использованием методов массового производства, но только до определенного предела. На этом этапе продукт или услуга адаптируются к потребностям или желаниям отдельных клиентов. Например, компания American Leather, производитель мебели из Далласа, использует массовую индивидуальную настройку для производства диванов и стульев в соответствии с требованиями заказчика в течение 30 дней.Базовые рамы в мебели такие же, но автомат для резки предварительно определяет цвет и тип кожи, заказанный каждым клиентом. Затем они добавляются к каждому кадру с использованием методов массового производства.

Настройка — это противоположность массового производства. При индивидуальной настройке фирма производит товары или услуги по одному в соответствии с конкретными потребностями или желаниями отдельных клиентов. В отличие от массовой настройки каждый продукт или услуга уникальны. Например, типография может обрабатывать множество проектов, включая информационные бюллетени, брошюры, канцелярские товары и отчеты.Каждое задание на печать различается по количеству, типу процесса печати, переплету, цвету чернил и типу бумаги. Фирма-производитель, которая производит товары в соответствии с заказами клиентов, называется мастерской по трудоустройству.

Классификация видов продукции

(авторство: Copyright Rice University, OpenStax, под лицензией CC BY 4.0.)

Массовое производство	Массовая настройка	Настройка
Продукты или услуги с высокой степенью однородности Многие продукты производятся последовательно	Единое стандартизованное производство до определенной точки, затем к каждому продукту добавлены уникальные особенности	Каждый продукт или услуга производится в соответствии с индивидуальными требованиями заказчика
Примеры: Сухие завтраки, безалкогольные напитки и компьютерная клавиатура	Примеры: Компьютеры Dell, жилые дома и клюшки для гольфа Taylor Made	Примеры: Индивидуальные дома, юридические услуги и стрижки

Некоторые виды обслуживающего бизнеса также предоставляют индивидуальные услуги.Например, врачи должны учитывать болезни и обстоятельства каждого отдельного пациента, прежде чем разработать индивидуальный план лечения. Агенты по недвижимости могут разработать индивидуальный план обслуживания для каждого клиента в зависимости от типа дома, который человек продает или хочет купить. Различия между массовым производством, массовой настройкой и настройкой подытожены в (рисунок) .

Преобразование входов в выход

Как указывалось ранее, производство включает преобразование вводимых ресурсов (природные ресурсы, сырье, человеческие ресурсы, капитал) в выпусков (продукты или услуги).В производственной компании входы, производственный процесс и конечные результаты обычно очевидны. Например, Harley-Davidson перерабатывает сталь, резину, краску и другие материалы для производства мотоциклов. Но производственный процесс в сервисной компании предполагает менее очевидную конверсию. Например, больница превращает знания и навыки своего медицинского персонала, а также оборудование и материалы из различных источников в медицинские услуги для пациентов. (рисунок) предоставляет примеры входов и выходов, используемых различными другими предприятиями.

Есть два основных процесса преобразования входов в выходы. В непрерывном производстве основные входы (природные ресурсы, сырье) разбиваются на один или несколько выходов (продуктов). Например, боксит (вход) перерабатывается для извлечения алюминия (выход). Процесс сборки прямо противоположный. Основные входы, такие как природные ресурсы, сырье или человеческие ресурсы, либо объединяются, для создания выходных данных, либо преобразуются в в выходные.Например, самолет создается путем сборки тысяч деталей, которые являются его сырьем. Производители стали используют тепло для превращения железа и других материалов в сталь. В сфере услуг клиенты могут играть роль в процессе трансформации. Например, служба подготовки налоговых деклараций объединяет знания составителя налоговой декларации с информацией клиента о личных финансах, чтобы заполнить налоговую декларацию.

Сроки производства

Второе соображение при выборе производственного процесса — это время.В непрерывном процессе используются длительные производственные циклы, которые могут длиться дни, недели или месяцы без остановки оборудования. Это лучше всего подходит для больших объемов продуктов с небольшим ассортиментом и стандартизованными деталями, такими как гвозди, стекло и бумага. Некоторые службы также используют непрерывный процесс. Примером может служить ваша местная электрическая компания. Удельные затраты низкие, а производство легко планировать.


Преобразование входов в выход
Тип организации	Ввод	Выход
Авиакомпания	Пилоты, бортпроводники, система бронирования, билетные агенты, клиенты, самолеты, бригады технического обслуживания, наземное оборудование	Перемещение клиентов и грузов
Продуктовый магазин	Товары, здание, клерки, контролеры, оборудование для магазинов, тележки для покупок, покупатели	Продовольственные товары для покупателей
Средняя школа	Факультет, учебная программа, здания, аудитории, библиотека, аудитория, гимназия, студенты, сотрудники, расходные материалы	Выпускники, государственная служба
Производитель	Машины, сырье, завод, рабочие, менеджеры	Готовая продукция для потребителей и других фирм
Ресторан	Еда, кухонное оборудование, серверы, повара, посудомоечные машины, хозяин, посетители, мебель, сантехника	Питание постоянных клиентов

В прерывистом процессе короткие производственные партии используются для изготовления партий различных продуктов.Машины выключаются, чтобы менять их, чтобы производить разные продукты в разное время. Этот процесс лучше всего подходит для мелкосерийных и разнообразных продуктов, например, произведенных путем массовой настройки или настройки. Магазины вакансий — это примеры фирм, использующих прерывистый процесс.

Хотя некоторые сервисные компании используют непрерывные процессы, большинство сервисных компаний полагаются на прерывистые процессы. Например, ресторан, готовящий изысканные блюда, врач, проводящий хирургические процедуры, и рекламное агентство, разрабатывающее рекламные кампании для бизнес-клиентов, — все они адаптируют свои услуги к каждому клиенту.Они используют прерывистый процесс. Обратите внимание, что их «производственные циклы» могут быть очень короткими — один лосось на гриле или одно медицинское обследование за раз.

Опишите различные типы производственных процессов.
Как вводимые ресурсы преобразуются в выпуск в различных отраслях?

Сводка результатов обучения

Какие типы производственных процессов используют производители и обслуживающие компании?

Продукция изготавливается с использованием одного из трех типов производственных процессов.При массовом производстве одновременно производится множество идентичных товаров, что снижает производственные затраты. Поэтому массовое производство в значительной степени зависит от стандартизации, механизации и специализации. Когда используется массовая настройка, товары производятся с использованием методов массового производства до определенного момента, после чего продукт или услуга адаптируются к индивидуальным потребностям отдельных клиентов путем добавления специальных функций. Когда производственный процесс фирмы строится на индивидуальной настройке, она производит множество продуктов по одной в соответствии с очень конкретными потребностями или желаниями отдельных клиентов.

Глоссарий

процесс сборки: Производственный процесс, в котором основные входы либо объединяются для создания выхода, либо преобразуются в выход.

непрерывный процесс: Производственный процесс, в котором используются длительные производственные циклы, длящиеся дни, недели или месяцы без остановок оборудования; обычно используется для крупносерийной продукции с небольшим ассортиментом и стандартизованными деталями.

настройка: Производство товаров или услуг по отдельности в соответствии с конкретными потребностями или желаниями отдельных клиентов.

прерывистый процесс: Производственный процесс, в котором используются короткие производственные партии для изготовления партий различных продуктов; обычно используется для мелкосерийных разнообразных продуктов.

мастерская: Фирма-производитель, которая производит товары по заказам клиентов.

массовая настройка: Производственный процесс, при котором товары производятся серийно до определенного момента, а затем адаптируются к потребностям или желаниям отдельных клиентов.

массовое производство: Производство сразу множества одинаковых товаров.

непрерывное производство: Производственный процесс, в котором основные входные данные разбиваются на один или несколько выходов (продуктов).

производственный процесс: Способ создания товара или услуги.

Определение массового производства

Что такое массовое производство?

Массовое производство — это производство больших объемов стандартизированной продукции, часто с использованием сборочных линий или технологий автоматизации.Массовое производство способствует эффективному производству большого количества аналогичных продуктов.

Массовое производство также называется поточным, серийным или серийным производством.

В массовом производстве механизация используется для достижения больших объемов, детальной организации потока материалов, тщательного контроля стандартов качества и разделения труда. Первым примером спроса на стандартизированную продукцию в больших количествах послужили военные организации, которые нуждались в униформе и других принадлежностях.Оборудование для высокоточной механической обработки привело к появлению большого спроса на продукцию массового производства, дешево создаваемую небольшой рабочей силой.

Ключевые выводы

Массовое производство — это производство больших партий стандартизированной продукции, часто с использованием сборочных линий или средств автоматизации.
Массовое производство имеет множество преимуществ, таких как высокий уровень точности, более низкие затраты на автоматизацию и меньшее количество рабочих, более высокий уровень эффективности, а также быстрое распространение и маркетинг продукции организации.
Генри Форд, основатель Ford Motor Company, в 1913 году разработал конвейерную технологию массового производства.

Преимущества массового производства

Массовое производство имеет много преимуществ. Если производство строго контролируется, массовое производство может привести к высокому уровню точности, поскольку машины производственной линии имеют предварительно заданные параметры. Массовое производство также приводит к снижению затрат, поскольку процесс производства на автоматизированной сборочной линии требует меньше рабочих.

Кроме того, массовое производство может обеспечить более высокий уровень эффективности, поскольку изделия массового производства могут быть собраны быстрее за счет автоматизации. Быстрая сборка способствует быстрому распространению и маркетингу продукции организации, что, в свою очередь, может создать конкурентное преимущество и более высокую прибыль для компании. Например, McDonald’s (MCD) имеет конкурентное преимущество в индустрии быстрого питания из-за скорости, с которой он может приготовить еду для клиентов, заботящихся о времени.

Недостатки массового производства

Однако не все в массовом производстве выгодно. Создание автоматизированной сборочной линии — дело капиталоемкое и требует значительных предварительных затрат времени и ресурсов. Если в производственном проекте есть ошибка, могут потребоваться значительные затраты времени и денег на перепроектирование и перестройку процессов массового производства.

Пересмотр процессов массового производства может потребоваться по причинам, не связанным с ошибками.Например, если у фармацевтической компании есть комплексная сборочная линия для производства популярного лекарственного препарата, для нее было бы много времени и денег, чтобы отреагировать на нормативные изменения Управления по контролю за продуктами и лекарствами (FDA), требующие другого производственного процесса. .

Хотя преимущество массового производства состоит в том, что оно может снизить затраты на рабочую силу, у сотрудников, которые остаются на конвейере, может отсутствовать мотивация, поскольку их задачи повторяются. Скука, вызванная повторяющейся работой, может привести к снижению морального духа сотрудников и увеличению текучести кадров.

Производители экспериментируют с интеграцией трехмерных (3-D) принтеров в массовое производство повседневных товаров.

Пример массового производства

Генри Форд, основатель Ford Motor Company, разработал конвейерную технологию массового производства. В 1913 году он первым запустил движущуюся сборочную линию для производства автомобиля Ford Model T. Сокращение времени производства деталей позволило компании применить тот же метод к сборке шасси и резко сократить время, необходимое для создания автомобиля Model T.

Форд продолжал совершенствовать этот процесс, даже наняв кого-то, кто изучал наиболее эффективные способы передвижения людей. Между 1908 и 1927 годами Ford построил 15 миллионов автомобилей Model T. В результате массового производства Ford автомобили стали чем-то, что могла позволить себе широкая публика, а не предметом роскоши, доступным лишь ограниченному кругу людей.

Инновационный метод производства Генри Форда до сих пор используется компаниями, стремящимися к быстрому созданию стандартизированной продукции.

Промышленные пивные дрожжи, сконструированные для производства первичных детерминант вкуса в охмеленном пиве

Клонирование

Все штаммы, экспрессионные плазмиды и дополнительные плазмиды, используемые для конструирования штаммов, перечислены и описаны в дополнительных таблицах 6–13.Файлы последовательностей, соответствующие каждой плазмиде, можно найти в публичном реестре JBEI (https://public-registry.jbei.org/) ³¹. Плазмиды размножали в штамме Escherichia coli Dh20B и очищали с помощью Miniprep (Qiagen, Germantown, MD, США). Плазмиды «пути», использованные для создания сконструированных пивоваренных штаммов, были собраны стандартным методом Golden Gate с использованием рестрикционных ферментов типа II и ДНК-лигазы Т7 (New England Biolabs, Ипсвич, Массачусетс, США) ^24,32 (для дополнительных деталей, см. схематическую стратегию сборки на дополнительном рис.3). Все другие плазмиды, полученные в этом исследовании, были сконструированы сборкой Гибсона ³³ с использованием мастер-микса сборки Гибсона (New England Biolabs, Ипсвич, Массачусетс, США). Конструкции были разработаны с использованием программного обеспечения DeviceEditor bioCAD ³⁴, а сборочные праймеры были созданы с помощью программного обеспечения для автоматизации конструирования сборки ДНК j5 ³⁵ с использованием настроек по умолчанию. ПЦР-амплификацию проводили с использованием ДНК-полимеразы PrimeSTAR GXL в соответствии с инструкциями производителя (Takara Bio, Mountain View, CA, USA).Гены, кодирующие полноразмерные линалоол и гераниолсинтазы, были заказаны либо у IDT (Сан-Диего, Калифорния, США) в виде G-блоков, либо у Life Technologies (Карлсбад, Калифорния, США) в виде цепочек ДНК. Кодирующие последовательности гетерологичных генов во всех плазмидах были подтверждены секвенированием по Сэнгеру (Genewiz, Саут-Плейнфилд, Нью-Джерси, США и Quintara, Южный Сан-Франциско, Калифорния, США).

Конструкция штамма

Лабораторные штаммы дрожжей трансформировали высокоэффективным методом ацетата лития ³⁶.Штаммы культивировали в среде дрожжевой экстракт + пептон + декстроза (YPD), если не указано иное. Для отбора трансформантов, содержащих кассеты ауксотрофной комплементации, трансформированные клетки высевали на стандартную среду для выпадения (Sunrise Science Products, Сан-Диего, Калифорния, США). Для отбора трансформантов, содержащих кассеты устойчивости к лекарствам, клетки выделяли в среде YPD в течение 4 часов после трансформации, а затем высевали на среду YPD с добавлением 200 мкг / л генетицина (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) или гигромицина B. (Сигма-Олдрич, Св.Луис, Миссури, США). Незначительные изменения были внесены в условия культивирования для трансформации пивных дрожжей: культуры перед трансформацией выращивали в среде YPD с добавлением 200 мг / л сульфата аденина при 20 ° C в стеклянных пробирках со встряхиванием при 200 об / мин. Одну колонию использовали для инокуляции исходной 5 мл культуры, которую выращивали в течение ночи до помутнения. Эту культуру использовали для инокуляции второй культуры объемом 5 мл с OD ₆₀₀ (оптическая плотность при 600 нм) 0,01, которую выращивали в течение 18 часов.Затем вторую культуру использовали для инокуляции культур объемом 50 мл в колбах Эрленмейера на 250 мл до OD ₆₀₀ 0,05. После ~ 8 часов роста штаммы трансформировали методом ацетата лития ³⁶, клетки выделяли в среде YPD в течение 4 часов, высевали на YPD с добавлением 200 мкг / л генетицина, а затем выращивали в течение 5-7 дней при 20 ° C. ° C.

ДНК, используемую для геномной интеграции, получали либо с помощью ПЦР-амплификации плазмидной ДНК, либо путем переваривания плазмиды рестрикционными ферментами. Для конструирования штамма, гипер-продуцирующего GPP, интеграционные фрагменты амплифицировали из соответствующих плазмид с помощью ПЦР (дополнительная таблица 7).Для конструирования пивоваренных штаммов, интегрированных в путь, плазмидную ДНК линеаризовали рестрикционным расщеплением с Not I-HF и Pst I-HF (New England Biolabs, Ипсвич, Массачусетс, США) (дополнительные таблицы 10 и 11).

Все события интеграции были подтверждены диагностической ПЦР с использованием GoTaq Green Master Mix (Promega, Мэдисон, Висконсин, США). Для штаммов пивных дрожжей гомозиготность в локусе интеграции тестировали с использованием праймеров, нацеленных на 5 ‘и 3’ соединения желаемого аллеля и родительского аллеля.Идентичность мультигенной интеграции проверяли с помощью праймеров, нацеленных на каждое из четырех сочленений промотор / ген. Идентификационные данные промоторов, соответствующие каждому штамму, можно найти в дополнительных таблицах 12 и 13.

Скрининг синтаз

Для скрининга линалоола и гераниолсинтазы отдельные колонии отбирали из планшета для трансформации и использовали для инокуляции культур в 5 мл CSM-Leu. (Восход солнца) + 2% рафинозы (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) среда. Через 24 ч прекультуры разбавляли свежим CSM-Leu + 2% галактозы (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA) среду до OD 0,05 и выращивали в течение 72 ч при встряхивании при 200 об / мин. Через 24 часа после инокуляции добавляли органический слой для улавливания гидрофобных монотерпенов. Декан использовали в качестве верхнего слоя для культур, экспрессирующих LIS, а додекан использовали для культур, экспрессирующих GES. Наложение было выбрано таким образом, чтобы минимизировать перекрытие времен удерживания между растворителем и продуктом для последующего анализа методом газовой хроматографии и масс-спектрометрии (ГХ / МС).

Микроаэробная ферментация

Штаммы наносили штрихами на среду YPD и выращивали в течение 2 дней при 25 ° C.Одиночные колонии использовали для инокуляции исходных 2 мл прекультур в 24-луночные планшеты (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США), которые выращивали в течение 3 дней при 20 ° C со встряхиванием при 200 об / мин. Штаммы выращивали в базовой среде, состоящей из 100 г / л солодового экстракта (ME) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Каждая лунка содержала стеклянный шарик 5 мм (Chemglass Life Sciences, Вайнленд, Нью-Джерси, США). Полученные культуры использовали для инокуляции вторых 6 мл предварительных культур в свежие 24-луночные планшеты до OD 0,1, которые затем выращивали в течение 3 дней при 20 ° C со встряхиванием при 120 об / мин.Затем полученные культуры использовали для инокуляции 25 мл культур в стеклянных пробирках до OD 1,0. Эти культуры были оснащены односторонним воздушным затвором для микроаэробной ферментации и выращивались в течение 5 дней при 20 ° C (дополнительный рисунок 5). Пробирки встряхивали в течение 30 с каждые 24 ч.

Высокоэффективная жидкостная хроматография

Мальтотриозу, мальтозу, глюкозу и этанол разделяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и определяли детектором показателя преломления (RI).На 5 день образцы ферментации центрифугировали при 18000 × g в течение 5 минут, фильтровали с использованием фильтров для центрифужных пробирок Costar ^® Spin-X ^®, поры 0,22 мкм, переносили в пробирки для ВЭЖХ и загружали в Agilent 1100. ВЭЖХ с автоматическим пробоотборником Agilent серии 1200, ионообменной колонкой Aminex HPX-87H (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния, США) и детектором Agilent серии 1200 RI. Метаболиты разделяли с использованием 4 мМ водного раствора H ₂ SO ₄ с расходом 0.6 мл / мин при 50 ° C. Абсолютные концентрации образцов рассчитывались с использованием линейной модели, построенной на основе стандартной кривой, состоящей из аутентичных стандартов мальтотриозы, мальтозы, глюкозы и этанола (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), разведенных в воде в диапазоне 0,2–20 г. / L. Все данные представлены в дополнительной таблице 15.

Количественное определение монотерпенов

Монотерпены были количественно определены с помощью анализа ГХ / МС с использованием системы ГХ-МС Agilent серии 6890 с масс-селективным детектором 5973.Во всех экспериментах вводили 1 мкл образца (без разделения) с использованием He в качестве газа-носителя в колонку CycloSil-B (Agilent, длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм, кат. 112-6632). Газ-носитель поддерживали при постоянной скорости потока 1,0 мл / мин, а режим EMV был установлен на коэффициент усиления 1.

Отбор проб, температурный режим печи и ионный мониторинг были оптимизированы для каждого эксперимента: для количественного определения производства линалоола и гераниола. в ситах для терпен-синтазы образцы центрифугировали и собирали органическую фазу (наложенный растворитель), разбавленную 1:10 этилацетатом (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO, USA), переносили в стеклянный флакон для ГХ и вводили в колонку для ГХ. Для образцов, соответствующих экрану LIS, температуру печи поддерживали на уровне 50 ° C в течение 12 мин, после чего следовало повышение со скоростью 10 ° C / мин до температуры 190 ° C и повышение со скоростью 50 ° C / мин до конечного значения. температуре 250 ° C, а затем выдерживали при 250 ° C в течение 1 мин. Задержка растворителя была установлена на 20 мин, а МС был установлен в режим SIM для сбора данных, мониторинга m / z ионов 80, 93 и 121. Для образцов, соответствующих экрану гераниолсинтазы, поддерживалась температура печи. при 50 ° C в течение 5 минут, затем с линейным изменением со скоростью 30 ° C / мин до температуры 135 ° C, затем с линейным изменением со скоростью 5 ° C / мин до температуры 145 ° C, затем с линейным изменением со скоростью 30 ° C / мин до температуре 250 ° C и выдерживали при 250 ° C в течение 1 мин.Задержка растворителя была установлена на 10,8 мин, а МС был настроен на мониторинг m / z ионов 69, 93, 111 и 123. Для количественного определения линалоола и гераниола в микроаэробных ферментациях, проводимых с пивными дрожжами, образцы были извлечены в день. 5 с использованием этилацетата. Образцы ферментации собирали и центрифугировали, 1600 мкл супернатанта смешивали с этилацетатом в соотношении 4: 1 в 96-луночном планшете, планшет герметично закрывали и встряхивали в течение 2 минут, затем центрифугировали при 3000 × г в течение 5 мин и 30 мкл этилацетата переносили в стеклянный сосуд для ГХ.Полученный препарат вводили в колонку для ГХ. Для количественного определения линалоола и гераниола в различных коммерческих сортах пива 2 мл этилацетата добавляли к 8 мл пива в стеклянных пробирках (Kimble Chase, Rockwood, TN, USA). Его перемешивали вручную в течение 2 минут и центрифугировали при 1000 × г в течение 10 минут. Тридцать микролитров этилацетатного слоя переносили в стеклянные сосуды для ГХ, и полученный препарат вводили в колонку для ГХ. Как для экспериментов по микроаэробной ферментации, так и для отбора проб коммерческого пива температуру печи поддерживали на уровне 50 ° C в течение 5 минут, после чего следовало повышение со скоростью 5 ° C / мин до температуры 200 ° C и повышение на 50 ° C / мин до конечной температуры 250 ° C, а затем выдерживают при 250 ° C в течение 1 мин.Задержка растворителя была установлена на 5 минут, а МС был настроен на мониторинг м / z ионов 55, 69, 71, 80, 81, 93, 95, 107, 121, 123 и 136.

Площади пиков линалоол и гераниол определяли количественно с использованием программного обеспечения MSD Productivity ChemStation (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США). Абсолютные концентрации образцов рассчитывали с использованием линейной модели, построенной на основе стандартной кривой, составленной для аутентичных стандартов линалоола и гераниола (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США).Для экспериментов по скринингу монотерпенсинтазы стандарты разбавляли этилацетатом в диапазоне 0,2–50 мг / л. Для экспериментов по микроаэробной ферментации и отбора проб коммерческого пива стандарты добавляли к препарату, извлеченному из образца ферментации родительского штамма (т. Е. Контрольному препарату, используемому для обеспечения точного базового сигнала) в диапазоне 0,2–10 мг / л. При вычислении фактических концентраций кажущиеся концентрации были масштабированы на основе разведения или концентрации в препарате для инъекции ГХ.

Proteomics

Данные о содержании белка представлены в дополнительной таблице 16. Образцы культуры (5 мл) отбирали через 2 дня, встряхивали и центрифугировали при 3000 × г в течение 5 минут. Супернатант отбрасывали, а осадок мгновенно замораживали. Осадки клеток на планшетах лизировали осаждением хлороформ-метанол, как описано ниже, в то время как образцы в пробирках лизировали путем повторного суспендирования осадка в 600 мкл буфера для лизиса дрожжей (6 М мочевина в 500 мМ бикарбоната аммония) с последующим взбиванием шариков. с шариками из диоксида циркония / диоксида кремния 500 мкл (0.Диаметр 5 мм; BioSpec Products, Бартлсвилл, Оклахома, США). Образцы в пробирках подвергали взбиванию шариками в течение пяти циклов по 1 мин с 30 с на льду между каждым циклом. Затем их центрифугировали в настольной центрифуге на максимальной скорости в течение 2 мин для осаждения обломков клеток, а прозрачный лизат переносили в свежие пробирки. Лизис клеток на планшете и осаждение белка достигали с использованием экстракции хлороформ-метанол ³⁷. Осадки ресуспендировали в 60 мкл метанола и 100 мкл хлороформа, а затем в 50 мкл гранул диоксида циркония / диоксида кремния (0.Диаметр 5 мм; BioSpec Products, Bartlesville, OK, USA) добавляли в каждую лунку. Планшет подвергали ударным нагрузкам в течение пяти циклов по 1 мин с 30 с на льду между циклами. Супернатанты переносили в новый планшет и добавляли 30 мкл воды в каждую лунку. Планшет центрифугировали 10 мин при максимальной скорости, чтобы вызвать разделение фаз. Слои метанола и воды удаляли, а затем в каждую лунку добавляли 60 мкл метанола. Планшет центрифугировали еще 10 мин при максимальной скорости, затем слои хлороформа и метанола удаляли и осадки белка сушили при комнатной температуре в течение 30 мин перед повторным суспендированием в 100 мМ бикарбонате аммония с 20% метанолом.

Концентрацию белка в образцах измеряли с помощью набора DC Protein Assay Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), используя бычий сывороточный альбумин в качестве стандарта. Всего 50 мкг белка из каждого образца переваривали трипсином для целевого протеомного анализа. Образцы белка восстанавливали путем добавления трис 2- (карбоксиэтил) фосфина до конечной концентрации 5 мМ с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 30 минут. Йодацетамид добавляли до конечной концентрации 10 мМ для алкилирования образцов белка, а затем инкубировали в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре.Трипсин добавляли в соотношении трипсин: общий белок 1:50, и образцы инкубировали в течение ночи при 37 ° C.

Пептиды анализировали с использованием системы жидкостной хроматографии Agilent 1290, соединенной с масс-спектрометром Agilent 6460 QQQ (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США). Образцы пептида (10–20 мкг [LC2]) разделяли на колонке Ascentis Express Peptide ES-C18 (размер частиц 2,7 мкм, размер пор 160 Å, длина 5 см × внутренний диаметр 2,1 мм, соединенный с колонкой 5 мм × 2,1 мм. id защитная колонка с аналогичным размером частиц и пор; Sigma-Aldrich, St.Луис, штат Миссури, США), при этом система работала со скоростью потока 0,400 мл / мин и отсеком колонки при 60 ° C. Пептиды элюировали в масс-спектрометр через градиент с начальными исходными условиями 95% буфера A (0,1% муравьиной кислоты) и 5% буфера B (99,9% ацетонитрила, 0,1% муравьиной кислоты). Буфер B выдерживали на уровне 5% в течение 1,5 мин, а затем увеличивали до 35% буфера B в течение 3,5 мин. Буфер B был дополнительно увеличен до 80% за 0,5 мин, где он выдерживался в течение 1 минуты, а затем снова снизился до 5% буфера B за 0.3 мин, где ее выдерживали в течение 0,2 мин для повторного уравновешивания колонки до начального начального состояния. Пептиды были ионизированы источником Agilent Jet Stream ESI, работающим в режиме положительных ионов со следующими параметрами источника: температура газа = 250 ° C, поток газа = 13 л / мин, давление распылителя = 35 psi, температура газа в оболочке = 250 ° C, поток газа через оболочку = 11 л / мин, VCap = 3500 В. Данные были получены с помощью Agilent MassHunter, версия B.08.00. Полученные файлы данных были обработаны с использованием Skyline ³⁸ версии 3.6 (лаборатория MacCoss, Вашингтонский университет, Сиэтл, Вашингтон, США), а количественная оценка пиков была уточнена с помощью mProphet ³⁹ в Skyline.

Анализ данных

Анализ данных проводился с использованием языка статистического программирования R ⁴⁰. Дополнительные библиотеки использовались для функций визуализации данных ^{41,42,43,44,45}. Для тепловых карт анализа белков и метаболитов (рис. 2e и дополнительный рис. 9) относительные уровни были представлены следующим образом: силы промоторов были представлены как доли от их ранее сообщенного рангового порядка ²⁴ в диапазоне от P _RNR2 (0 ) до П _ТДх4 (1).\ prime = \ frac {{s_i — {\ mathrm {min}} (S)}} {{{\ mathrm {max}} (S) — {\ mathrm {min}} (S)}} $$

(1)

Для анализа сахара неферментированный МЭ был включен в расчет макс / мин. Для сбраживаемых сахаров (т.е. мальтотриозы, мальтозы, глюкозы) масштабированные значения вычитали из 1, чтобы представить близость к желаемому профилю потребления сахара.

Метрика расстояния сконструированного штамма по отношению к данному коммерческому пиву была рассчитана с использованием манхэттенской длины как расстояния между производством монотерпена и концентрацией монотерпена в пиве, а также расстояния потребления сахара от родительского штамма.Сначала для каждого вида, линалоола и гераниола, рассчитывалась разница между log ₁₀-преобразованными значениями концентрации монотерпена сконструированного штамма и целевой концентрацией монотерпена в пиве. Во-вторых, были рассчитаны абсолютные значения этих различий. Наконец, полученные значения вместе с долей общего сахара, оставшейся после ферментации, усредняли.

Математическое моделирование

На Python были построены три разные модели для прогнозирования продукции монотерпена на основе уровней белка (подробное описание и реализацию см. В файле дополнительных данных 1).Файлы, содержащие данные, используемые для создания прогнозных моделей, включены в качестве дополнительных файлов данных 2 и 3. И гауссовский регрессор, и линейные модели были реализованы с использованием Scikit-learn ⁴⁶. Дополнительные уравнения, необходимые для описания линейной модели, приведены в дополнительной таблице 3. Уравнения, описывающие кинетическую модель Михаэлиса – Ментен, приведены в дополнительной таблице 4, а схематическая структура модели представлена на дополнительном рисунке 13. Кинетические параметры были взяты из литература (дополнительная таблица 5) и концентрации белка приведены в дополнительном файле данных 2.Были включены свободные параметры для преобразования относительных количеств белка в абсолютные значения белка. Кроме того, параметр β определял относительное соотношение между эндогенными FPPS и FPPS *.

Модели линейного и гауссовского регрессоров были подобраны с использованием стандартных методов из библиотеки Scikit Learn. Кинетическая модель была построена вручную без внешних библиотек. Чтобы соответствовать кинетической модели, был использован алгоритм дифференциальной эволюции для выполнения оптимизации параметров нелинейной функции стоимости.В частности, сумма квадратов остаточной ошибки прогнозов модели на основе деформаций первой итерации была минимизирована по отношению к ранее описанным параметрам. Кинетические коэффициенты были ограничены, чтобы изменяться на порядок величины от значений, описанных в литературе. Для перекрестной проверки моделей и минимизации переобучения к каждой модели применялась методология исключения по одному. Остаточные погрешности этого метода перекрестной проверки приведены в дополнительной таблице 2.

Анализ, проведенный для прогнозирования степени улучшения характеристик штаммов второй итерации (рис. 4 и дополнительный рис. 10) по сравнению со случайно созданными штаммами, описан в дополнительном примечании 3.

Анализ токсичности

OD _{600 Было проведено} измерений в 48-луночных прозрачных планшетах с плоским дном (Corning Inc., Корнинг, Нью-Йорк, США) с использованием считывающего устройства Tecan Infinite F200 PRO с регистрацией каждые 15 мин. Анализ проводился с использованием пользовательских скриптов Python.Кривые роста рассчитывали путем усреднения шести биологических повторов; заштрихованные области представляют одно стандартное отклонение от среднего. Скорость роста рассчитывалась с использованием скользящего окна 5 ч, что позволяло найти максимальную скорость роста. Скорость роста представлена как среднее значение для шести биологических повторов; планки погрешностей представляют собой 95% доверительные интервалы (дополнительный рисунок 12).

Пилотные ферментации

Штаммы наносили штрихами на среду YPD и выращивали в течение 2 дней при 25 ° C. Одиночные колонии использовали для инокуляции исходных культур объемом 5 мл в стеклянные пробирки, которые выращивали в течение 2 дней при 20 ° C со встряхиванием при 200 об / мин.Полученные культуры использовали для инокуляции 1 л культур в 2-литровых стеклянных колбах Эрленмейера, которые затем выращивали в течение 3 дней при 20 ° C со встряхиванием со скоростью 200 об / мин. Штаммы выращивали в базовой среде, состоящей из 100 г / л ME (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Затем полученные культуры использовали для инокуляции промышленных ферментаций сусла, произведенного на экспериментальной пивоварне объемом 1,76 гл.

Для первой серии ферментаций 35 кг двухрядного солода измельчали и добавляли к 105 л деионизированной воды, обработанной 79.15 г пивоваренных солей. Затирание проводили в течение 30 минут при 65 ° C, 10 минут при 67 ° C и 10 минут при 76 ° C. Суслу давали рециркулировать в течение 10 минут и отделяли фильтрованием. Барботирование происходило в течение 58 минут, давая конечный объем перед кипячением в варочном котле 215 л. Сусло кипятили до тех пор, пока оно не достигло конечного объема 197 л и плотности 11,65 ° Плато. Добавки в чайник включали 125 г гранул хмеля Magnum, 15,1 г питательных веществ для дрожжей Yeastex и 15 г Protofloc (Murphy and Son, Ноттингем, Великобритания).Ингредиенты были получены от Brewers Supply Group (Шакопи, Миннесота, США), если не указано иное. После отделения сусла от горячего осадка оно было перенесено в четыре специализированных ферментера на 56 л (JVNW, Канби, Орегон, США), каждый из которых был наполнен до 40 л. Пиво ферментировали при 19 ° C до достижения конечной плотности. в течение дополнительных 24 часов для удаления вицинального дикетона (VDK), а затем кондиционировали на холоде при 0 ° C. Продолжительность ферментации и, в свою очередь, продолжительность холодного кондиционирования зависела от штамма.Образцы отбирали каждые 24 часа для измерения ° Плато и pH (см. Дополнительный рисунок 11). Полученное пиво фильтровали под давлением и газировали перед хранением в бочонках емкостью 7,75 галлона. Образцы были собраны во время процесса кегирования для анализа Alcolyzer (Anton Paar, Ashland, VA) (см. Дополнительную таблицу 17).

Для второй серии ферментаций 35 кг двухрядного солода измельчали и добавляли к 105 л деионизированной воды, обработанной 79 г пивоваренных солей. Затирание проводили в течение 30 минут при 65 ° C, 10 минут при 67 ° C и 10 минут при 76 ° C.Суслу давали рециркулировать в течение 10 минут и отделяли фильтрованием. Барботирование происходило в течение 52 минут, давая конечный объем перед кипячением в варочном котле 214 л. Сусло кипятили до тех пор, пока оно не достигло конечного объема 194 л и плотности 11,25 ° Плато. Добавки в чайник включали 97,01 г гранул хмеля Galena, 15,1 г питательных веществ для дрожжей Yeastex и 15 г Protofloc (Murphy and Son, Ноттингем, Соединенное Королевство). Ингредиенты были получены от Brewers Supply Group (Шакопи, Миннесота), если не указано иное.После отделения сусла от горячего осадка оно было перенесено в четыре специальных ферментера на 56 л (JVNW, Canby, OR), каждый из которых был наполнен до 40 л. Пиво ферментировали при 19 ° C до достижения конечной плотности и выдерживали в течение некоторого времени. дополнительные 24 часа для удаления VDK, а затем холодное кондиционирование при 0 ° C. Продолжительность ферментации и, в свою очередь, продолжительность холодного кондиционирования зависела от штамма. Образцы отбирали каждые 24 часа для измерения ° Плато и pH (см. Дополнительный рисунок 11). Через 48 ч при 0 ° C 88,5 г сухого хмеля Cascade (либо из Вашингтона, либо из Айдахо) добавляли в два ферментера, содержащих родительский штамм WLP001 .Сухой хмель оставляли на пиве при 1,67 ° C на 1 неделю перед фильтрацией. Полученное пиво фильтровали под давлением и газировали перед хранением в бочонках емкостью 7,75 галлона. Образцы были собраны во время процесса кегирования для анализа Alcolyzer (Антон Паар, Ашленд, Вирджиния, США) (см. Дополнительную таблицу 18).

Сенсорный анализ

Одобрение Институционального наблюдательного совета на исследования на людях было получено от Управления защиты людей Калифорнийского университета в Беркли (номер протокола CPHS 2017-05-9941).Комитет по защите прав человека рассмотрел и одобрил заявку в соответствии с 7-й категорией федеральных нормативных актов.

Эксперты: Органолептический анализ сваренного пива был проведен в Lagunitas Brewing Company (Петалума, Калифорния, США). Первая группа состояла из 27 сотрудников-участников (17 мужчин и 10 женщин), вторая — из 13 сотрудников-участников (11 мужчин и 2 женщины), с опытом от 2 до 154 дегустационных сессий, которые посетили в 2017 календарном году. Возраст варьировался от среднего до среднего. От 20 до 50 лет.Все участники прошли базовую сенсорную подготовку в соответствии со стандартами Lagunitas.

Органолептический анализ: Образцы объемом 2 унции были представлены в прозрачных стаканах для бренди на 6 унций (Либби, Толедо, Огайо, США). Каждый член группы получил пять очков, один контроль и четыре образца (один слепой контроль и три переменные), расположенных случайным образом с помощью сбалансированной блочной конструкции. Блок-дизайн и сбор данных были выполнены с использованием программного обеспечения EyeQuestion ^® (Logic8 BV, Нидерланды). За один присест участников попросили оценить интенсивность аромата хмеля по сравнению с контролем по 9-балльной порядковой шкале, закрепленной на одном конце с отметкой «Нет разницы», а на другом конце — «Крайняя разница».”

Анализ данных: данные были проанализированы с использованием теста Даннета в сочетании с односторонним дисперсионным анализом с использованием EyeOpenR ^® (Logic8 BV, Нидерланды). Анализ проводился с доверительной вероятностью 95%. Слепой контроль используется в качестве эталонной выборки для учета возможной систематической ошибки оценки.

Сухое охмеление для оценки вариации между препаратами хмеля

Родительский штамм WLP001 наносили штрихами на среду YPD и выращивали в течение 2 дней при 25 ° C.Одиночная колония использовалась для инокуляции начальной 50 мл прекультуры в 250 мл стеклянной колбе Эрленмейера, которую выращивали в течение 1 дня при 20 ° C со встряхиванием при 200 об / мин. Штамм выращивали в базовой среде, состоящей из 100 г / л ME (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) с добавлением YPD. Полученную культуру использовали для инокуляции предкультуры объемом 1 л в стеклянной колбе Эрленмейера на 2 л, которую затем выращивали в течение 2 дней при 20 ° C со встряхиванием при 200 об / мин. Полученную культуру затем использовали для инокуляции четырех 2-литровых культур в 4-литровых стеклянных колбах Эрленмейера, которые затем выращивали в течение 1 дня при 20 ° C со встряхиванием со скоростью 200 об / мин.Затем полученные культуры использовали для инокуляции 8 л культур в 3-галлонных стеклянных бутылях (Midwest Supplies, Розвилл, Миннесота, США). Эти культуры были оборудованы односторонней воздушной пробкой для микроаэробной ферментации и выращивались в течение 6 дней при 20 ° C. Тем временем пять различных образцов хмеля Cascade, выращенных на фермах на северо-западе Тихого океана, были получены от YCH Hops (Якима, Вашингтон, США). Образцы хмеля измельчали с помощью ступки с пестиком и жидкого азота. На 6 день из ферментаций отбирали образцы (в качестве контролей без охмеления) и к каждой ферментации добавляли 25 г хмеля.Хмель оставляли настаиваться на 3 дня, после чего образцы собирали для анализа ГХ / МС.

Вариации от партии к партии

Штаммы наносили штрихами на среду YPD и выращивали в течение 2 дней при 25 ° C. Одиночные колонии использовали для инокуляции исходных 5 мл предварительных культур в стеклянные пробирки, которые выращивали в течение 2 дней при 20 ° C со встряхиванием при 200 об / мин. Штаммы выращивали в базовой среде, состоящей из 100 г / л ME (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Полученные культуры использовали для инокуляции 500 мл прекультур в 2-литровых стеклянных колбах Эрленмейера, которые затем выращивали в течение 1 дня при 20 ° C со встряхиванием со скоростью 200 об / мин.Затем полученные культуры использовали для инокуляции 8 л культур в 3-галлонных стеклянных бутылях (Midwest Supplies, Розвилл, Миннесота, США). Эти культуры были снабжены односторонним воздушным затвором для микроаэробной ферментации и выращивались в течение 12 дней при 20 ° C. Образцы были взяты на 12 день для анализа ГХ / МС.

Доступность данных

Авторы заявляют, что все данные, подтверждающие выводы этого исследования, доступны в документе и файлах с дополнительной информацией к нему. Данные о последовательностях и штаммы, полученные в этом исследовании, были депонированы в публичном реестре JBEI.См. Дополнительные таблицы 6–13 для получения информации о последовательностях и штаммах. Компьютерный код, используемый в этом исследовании, доступен из дополнительных данных 1.

Frontiers | Критический анализ коммерческого потенциала растений для продукции рекомбинантных белков

Введение

Функция белка определяется количеством и последовательностью аминокислот, которые контролируют трехмерную структуру полученного свернутого полипептида. Следовательно, белки представляют собой молекулы большой сложности и почти бесконечного разнообразия, что делает их пригодными для множества различных применений.В США и Европе было одобрено более 300 препаратов на основе белка, и на белки приходится почти треть всех разрабатываемых фармацевтических препаратов (Walsh, 2018). Белки также широко используются в промышленности, включая ферменты, используемые для производства текстильных изделий и химикатов, а также для обработки пищевых продуктов и кормов. Многие другие белки используются в качестве диагностических или исследовательских реагентов. Таким образом, спрос на рекомбинантные белки неуклонно растет, и прогнозируется, что в 2017 году рынок, оцениваемый в 1,654 миллиарда долларов США, достигнет 2 долларов США.850 миллиардов к 2022 году (Markets and Markets, 2017). Терапевтические белки (например, антитела, вакцины, ферменты, цитокины и факторы роста) составляют почти половину этого рынка, за ними следуют промышленные белки (например, технические ферменты) и исследовательские реагенты (например, антитела для обнаружения и очистки белков) (рынки и рынки, 2017). Рост рынка был поддержан достижениями в технологиях производства рекомбинантных белков, в том числе конструированием экспрессионных хозяев, оптимизацией предшествующего культивирования (например,g., конструкция биореактора, пищевые и физические параметры), а также разработка более эффективных методов экстракции и очистки белка. Большинство рекомбинантных белков в настоящее время продуцируются в прокариотических клетках (в основном, бактерия Escherichia coli ) и небольшом количестве хорошо охарактеризованных клеточных линий млекопитающих, таких как клетки яичника китайского хомячка (СНО). Другие системы используются в коммерческих процессах, но встречаются реже, включая клетки насекомых, дрожжи, водоросли и платформы бесклеточной экспрессии (Markets and Markets, 2017).Существует также несколько платформ, основанных на растениях и растительных клетках, но они не были включены в последние исследования рынка, что указывает на то, что они еще не занимают значительную долю производственных мощностей по производству белка. Даже в этом случае растения в качестве альтернативной платформы экспрессии предлагают уникальные преимущества, особенно когда целевые белки сложно продуцировать в обычных системах, требуются определенные качественные свойства, такие как определенные профили гликанов, и / или они должны производиться в более крупных масштабах в ответ на насущную потребность. .Улучшение уровней экспрессии и экономики последующей обработки будет способствовать использованию растений для коммерческого производства белка.

Обычные экспрессирующие системы — клетки млекопитающих и прокариот

Промышленность отдает предпочтение системам экспрессии рекомбинантных белков, которые имеют долгую и успешную репутацию, в частности, имея в виду три цели: высокое качество, высокие выходы и низкие затраты. Кроме того, такие системы должны соответствовать требованиям промышленного процесса в отношении надежности и экономической устойчивости, а также должны соответствовать нормативным требованиям.Это особенно актуально для фармацевтических белков, произведенных в соответствии с надлежащей производственной практикой (GMP), набором руководящих принципов, гарантирующих, что биофармацевтические препараты являются достаточными с точки зрения качества и согласованности от партии к партии, чтобы предотвратить вред для пациентов. Поэтому промышленность сосредоточила свои ресурсы на небольшом количестве клеточных систем, в частности, на клетках СНО и E. coli , которые в настоящее время считаются золотыми стандартами промышленного производства белков.

Многие сложные белки, включая большинство терапевтических антител, обычно продуцируются в клетках СНО, потому что они обладают способностью выполнять аутентичные посттрансляционные модификации, включая гликозилирование.Рекомбинантные белки, продуцируемые в клетках СНО, секретируются в культуральную среду для облегчения восстановления и очистки. Для увеличения продуктивности культур клеток СНО применялись различные стратегии, в том числе: (1) разработка производственных линий и векторов экспрессии, (2) амплификация кассеты экспрессии, (3) оптимизация среды для культивирования клеток, включая переключение от ранних составов, содержащих сыворотку, до химически определенных и почти свободных от белка составов, которые еще больше упрощают очистку белка, (4) увеличение плотности клеток во время культивирования и (5) внедрение стратегий ферментации, которые уравновешивают поступление питательных веществ при сохранении оптимальных условий культивирования (Хаусманн и др., 2018; Ritacco et al., 2018). Эти разработки привели к значительному увеличению урожайности. Например, в ранних процессах производства моноклональных антител титры достигали сотен миллиграммов на литр, но они увеличились до обычных титров 5-10 г / л, а в некоторых случаях до 20 г / л (Pujar et al., 2017), снизив стоимость товаров до 20 евро / г (Kelley, 2007). В сочетании с GMP-совместимыми клеточными линиями и процессами и хорошо установленными процедурами утверждения трудно представить, что платформа CHO будет заменена какой-либо другой системой экспрессии для производства сложных белков в ближайшем будущем.

Хотя клетки млекопитающих предпочитают продуцировать сложные белки, прокариотические клетки намного проще в обращении и намного дешевле с точки зрения требований к среде. Соответственно, если продукт представляет собой более простой белок, E. coli часто является идеальным выбором в качестве хозяина-продуцента. Действительно, первый рекомбинантный терапевтический белок (человеческий инсулин) был коммерчески произведен в E. coli с 1982 года (Baeshen et al., 2014). Многие другие коммерческие рекомбинантные белковые продукты, включая цитокины для лечения рака или технические ферменты для промышленного применения, были произведены в E.coli , но его статус золотого стандарта прокариотического хозяина обусловлен в основном историческими причинами, и ряд других прокариот может быть более подходящим (Sanchez-Garcia et al., 2016; Singh et al., 2016). В нашей лаборатории мы используем Pseudomonas fluorescens для крупномасштабного производства рекомбинантных белков, которые по умолчанию накапливаются в цитозоле или могут секретироваться в культуральную среду (Retallack et al., 2012). Например, мы выбрали цитозольное накопление для производства не содержащего фенилаланина белка массой 19 кДа, который можно использовать для диетического лечения пациентов, страдающих фенилкетонурией — врожденной ошибкой метаболизма, которая приводит к снижению метаболизма аминокислоты фенилаланина (Hoffmann et al. al., 2018). Белок, не содержащий фенилаланина, можно легко экстрагировать из клеток путем гомогенизации под высоким давлением и выделить с помощью на одной стадии аффинной очистки (рис. 1). Простое культивирование в среднем масштабе во встряхиваемых колбах на 2,5 л и объемом культивирования 0,5–1,0 л позволило получить урожай 2,5 г / л. Периодическая ферментация с подпиткой в биореакторах с рабочим объемом 5–350 л повысила производительность до 20 г / л, что позволило получить 3,5 кг целевого белка для испытаний на животных в течение нескольких недель и продемонстрировало возможность масштабного промышленного производства. процесс, который обеспечивает тонны в качестве добавки для производства пищевых продуктов без фенилаланина.

Рисунок 1 . Продукция 19 кДа без фенилаланина белка в P. fluorescens . После экстракции и удаления остатков клеток продукт очищали от осветленного экстракта одностадийной аффинной хроматографией с иммобилизованными ионами металлов. Из-за высокой концентрации белка репрезентативные образцы загрузки и фракции элюирования анализировали с помощью SDS-PAGE при соотношениях разведения 1:80, 1: 160 и 1: 320. Сильная полоса при ~ 32 кДа представляет белок, не содержащий фенилаланина — больший размер белка, вероятно, отражает комбинацию его высокого поверхностного заряда и в целом высокой стабильности, которая предотвращает полное разворачивание во время подготовки образца.Этот пример демонстрирует высокую эффективность стадии очистки: только следы других белков обнаруживаются в дополнение к целевому белку в конечной фракции элюирования, соответствующей чистоте> 95%.

Несмотря на доступность высокопроизводительных хозяев для экспрессии белков, существует постоянная потребность в улучшенных или полностью новых системах для снижения производственных затрат за счет повышения производительности, качества и / или выхода. В конце 1980-х — начале 1990-х годов растения и суспензионные культуры клеток растений были предложены в качестве альтернативных производственных систем (Hiatt et al., 1989; Fischer et al., 1999). В частности, масштабируемость систем на основе растений в сочетании с низкой стоимостью выращивания растений была предсказана как главный фактор снижения производственных затрат. Однако это обещание еще предстоит полностью реализовать, в основном из-за низкой урожайности растений и высоких затрат на извлечение и очистку продукта.

Растительные производственные системы и белковые продукты растительного происхождения

С 1990-х годов многие исследователи стремились производить рекомбинантные белки в растениях.Как правило, они отдавали предпочтение растениям, которые уже использовались для других исследовательских целей, потому что методы, необходимые для переноса генов, были легко доступны. Это привело к разработке чрезвычайно разнообразного набора производственных систем, включая целые растения, различные ткани и клеточные системы (волосатые корни и культуры клеточной суспензии), а также многочисленные подходы к экспрессии (стабильно трансформированные трансгенные и транспластомные растения, системы временной экспрессии, индуцируемая экспрессия и различные стратегии нацеливания на белок; Twyman et al., 2003, 2005; Schillberg et al., 2013; Spiegel et al., 2018). Поэтому подходящая платформа, вероятно, будет доступна для любого мыслимого продукта, но отсутствие стандартной платформы рассеивает и замедляет усилия по оптимизации производительности и затрудняет определение стандартов промышленного производства.

Что касается продуктов-кандидатов, исследования были сосредоточены в основном на биофармацевтических препаратах с более высокой добавленной стоимостью по сравнению с диагностическими и техническими белками. В этом контексте появились три основных класса белковых продуктов: антитела, вакцины-кандидаты и замещающие человеческие белки, такие как продукты крови (сывороточный альбумин человека), замещающие белки для общих и редких заболеваний (желудочная липаза для муковисцидоза, инсулин для лечения диабета, глюкоцереброзидаза. для болезни Гоше), факторов роста и цитокинов (Spiegel et al., 2018). Рекомбинантные антитела, фрагменты антител и слитые белки антител стали наиболее распространенными продуктами, экспрессируемыми в растениях (Nölke et al., 2003; Vasilev et al., 2016), поскольку они оба экономически важны как фармацевтические препараты (Walsh, 2018), а также относительно стабильный и легко поддающийся описанию. Это означает, что они накапливаются до высоких уровней (> 100 мг / кг веса свежего растения или> 100 мг / л питательной среды), их легко очистить даже из сложных растительных матриц, а их функциональность можно проверить с помощью простых анализов связывания.Однако титры антител в растениях по-прежнему сильно отстают от урожайности, достигаемой в настоящее время в клетках СНО, что делает сомнительным, что растения когда-либо станут пригодными в качестве рутинной коммерческой платформы для продуктов антител. Однако, как обсуждается ниже, существуют определенные нишевые рынки, где растения предлагают возможности, которые не могут быть сопоставлены с клетками CHO или какой-либо другой платформой.

Многие исследования, связанные с производством рекомбинантных белков в растениях, не отваживаются на суровые реалии коммерческой разработки, а вместо этого сосредоточены на задачах ранней стадии, таких как проверка экспрессии, оптимизация производства и очистки до определенной степени и завершение начальной функциональности анализы.Немногие исследования включали трансляционные исследования, демонстрирующие коммерческую конкурентоспособность, отчасти из-за финансовых и организационных проблем, которые необходимо преодолеть, прежде чем биофармацевтические препараты растительного происхождения могут быть протестированы в клинических испытаниях. Практически невозможно получить финансовую и коммерческую поддержку, если неясны рыночный потенциал и права интеллектуальной собственности, как в случае с большинством белковых продуктов, производимых на растениях. Но без серьезного экономического обоснования промышленность не перейдет от существующих систем производства микробов и млекопитающих к растениям, потому что риск не будет оправдан.Тем не менее, несколько кандидатов в биофармацевтические продукты растительного происхождения прошли клинические испытания, что помогло определить процессы, соответствующие GMP, которые сейчас одобрены регулирующими органами (Fischer et al., 2012, 2013; Sack et al., 2015). На рынок вышло небольшое количество, первой из которых была рекомбинантная глюкоцереброзидаза (prGCD), родовое название талиглюцераза альфа, продаваемая как Elelyso, которая производится в клетках моркови компанией Protalix Biotherapeutics (Rup et al., 2017; Zimran et al., 2018 ).

Учитывая длительные сроки и огромные инвестиции, необходимые для подтверждения концепции бизнес-потенциала биофармацевтических препаратов растительного происхождения, возможно, лучше выбрать низко висящие плоды.Это означает, что продукты, которые обеспечивают более быстрый доступ к рынку из-за менее строгих нормативных требований, как в случае с диагностическими, техническими и косметическими продуктами. Ключевые примеры включают диагностический реагент авидин, который был впервые коммерчески произведен из кукурузы 20 лет назад (Hood et al., 1997) и до сих пор продается компанией Sigma-Aldrich (каталожный номер A8706), а также человеческий эпидермальный фактор роста, произведенный из ячменя в качестве лекарственного средства. косметическая добавка, распространяемая компанией Sif Cosmetics (Исландия). Однако две основные проблемы, которые необходимо решить, прежде чем растения смогут стать более конкурентоспособными по сравнению с другими системами экспрессии, — это низкие выходы продуктов и стоимость последующей обработки.

Проблемы, связанные с производством рекомбинантного белка в растениях

В 1995 г. секреторные антитела были продуцированы в растениях табака с титром 500 мкг / г свежего растительного материала (Ma et al., 1995). Хотя это превышено модельными белками, такими как зеленый флуоресцентный белок, который временно экспрессировался в листьях Nicotiana benthamiana с выходом 4 мг / г сырой массы (Marillonnet et al., 2005; Yamamoto et al., 2018), или белок Cry2Aa2 Bacillus thuringiensis ( Bt ), который накапливается в виде кристаллов в хлоропластах табака с выходом ~ 5 мг / г сырой массы (De Cosa et al., 2001), другие продукты, включая антитела, редко накапливаются до уровней, превышающих 100 мкг / г сырой массы. И это несмотря на обширные исследования по оптимизации экспрессии и стабильности белка в растениях за счет воздействия на внутренние факторы (например, кассеты экспрессии, стратегии нацеливания на белок и коэкспрессию ингибиторов протеаз) и внешние факторы (например, параметры питания и физические параметры культивирования, влияющие на рост растений. и фитнес) (Twyman et al., 2013). Кроме того, проблема очистки белка от сложных растительных матриц снижает конечный урожай, одновременно повышая общие производственные затраты.

The Yield Challenge

Выход рекомбинантного белка определяется внутренней продуктивностью хозяина, биомассой экспрессирующего хозяина в данном объеме или области и потенциалом увеличения масштабов. Большинство подходов к повышению урожайности направлены на увеличение специфической для клеток продуктивности (qP) с помощью генной инженерии или оптимизации условий культивирования. В оптимизированных биопроцессах CHO qP может достигать 50–90 пг на клетку в день, тогда как секреторные плазматические клетки человека способны секретировать IgM со скоростью 200–400 пг на клетку в день (Hansen et al., 2017). Редко можно найти значения qP, указанные для заводских систем. Для суспензионной культуры клеток табака с максимальным выходом 100 мг / л полноразмерного антитела эквивалентное значение qP составляет 8,0 пг на клетку в день (Havenith et al., 2014). Хотя это на порядок ниже, чем максимальные значения qP элитных клеточных линий СНО, тем не менее, это многообещающе, поскольку дальнейшая оптимизация белковой продуктивности растений представляется возможной путем контроля генетических и эпигенетических факторов, а также параметров культивирования (Twyman и другие., 2013).

Основным ограничением растительных клеток является их размер. По сравнению с растительными клетками, клетки бактерий и млекопитающих довольно малы и достигают объема упакованных клеток (PCV) менее 5% в обычных пакетных культурах. Таким образом, общая стратегия повышения продуктивности заключается в увеличении плотности / количества клеток в процессе промышленного производства, что приводит к почти 50% -ному содержанию PCV. Напротив, растительные клетки имеют значительно больший объем, вызванный, главным образом, наличием доминирующего вакуолярного компартмента.Большой размер растительных клеток означает, что продуктивность суспензионных культур нельзя повысить за счет увеличения количества клеток, потому что в конце периода культивирования PCV уже составляет 60–80% от объема культуры. Размер растительных клеток можно уменьшить, увеличив осмоляльность культуральной среды для уменьшения вакуоли, что приведет к увеличению количества клеток при той же PCV, но даже в этом случае растительные клетки остаются намного крупнее, чем клетки млекопитающих и бактерии (Vasilev et al., 2013 ).

Выход белка также может быть увеличен за счет увеличения объема производства.Это включает в себя простой процесс увеличения масштаба при работе с суспензионными культурами растительных клеток, но затраты также увеличиваются, что не помогает улучшить коммерческую осуществимость (Raven et al., 2015). Ситуация иная для целых растений, которые способны производить гораздо больше биомассы, чем обычные ферментеры, и с меньшими затратами, даже когда выращивание ограничивается теплицами. Даже в этом случае увеличение урожайности за счет увеличения общего производства биомассы, а не собственной продуктивности переносит спрос на этапы экстракции и очистки белка, и это необходимо учитывать в отношении общих производственных затрат, как описано в разделе «Проблема очистки».”

В конечном счете, установки обладают высокой производительностью для синтеза белка, но производственная единица, представленная отдельной клеткой, слишком велика, чтобы быть конкурентоспособной с меньшими клетками обычных систем производства белка, которые, таким образом, достигают большей производительности при меньшей занимаемой площади. Одним из решений является удаление всех ненужных компонентов из растительных клеток, например вакуоли, для концентрации их производственной мощности и одновременного устранения факторов, снижающих выход белка, таких как эндогенные растительные протеазы (Schiermeyer et al., 2005; Мандал и др., 2016). На пути к этой цели аппарат для синтеза растительного белка был отделен от ненужных и нежелательных компонентов путем приготовления бесклеточных лизатов растений. Наиболее широко используемые лизаты получают из зародышей зародышей пшеницы и содержат все необходимое для транскрипции и трансляции, но тщательная промывка во время приготовления экстракта удаляет ингибиторы трансляции, так что полученные реакции транскрипции-трансляции in vitro достигают выходов 100 мкг / мл в однократный периодический процесс (Biotechrabbit, 2019a).В диализном мешке, в который непрерывно загружаются субстраты и постоянно удаляются небольшие побочные продукты ингибирования, выход может достигать 1000 мкг / мл (Biotechrabbit, 2019b). Однако приготовление экстрактов зародышей пшеницы занимает много времени и является дорогостоящим, а возможность масштабирования ограничивается миллилитровым диапазоном (Takai et al., 2010).

Недавно мы описали новый бесклеточный лизат на основе клеток табака BY-2. Лизат BY-2 (BYL) достигает выходов до 270 мкг / мл при продуцировании флуоресцентного белка eYFP и включает сопряженную реакцию транскрипции-трансляции в простом 18-часовом периодическом процессе (Buntru et al., 2014, 2015; Havenith et al., 2017). Продуктивность системы BYL была увеличена до 3000 мкг eYFP на мл за счет оптимизации подготовки лизата и компонентов реакции, а также за счет расширения процесса транскрипции-трансляции до 24–48 часов за счет включения активных митохондрий, доставляющих энергию для биосинтеза белка (неопубликованные данные ). Хотя известно, что модельные белки, такие как eYFP, накапливаются до очень высоких уровней, максимальные выходы оптимизированного BYL в 15 раз выше, чем у любой другой бесклеточной системы на основе партии эукариот, экспрессирующей аналогичные белки (рисунок 2), что демонстрирует огромную способность суспензионные культуры клеток табака для биосинтеза белков.Система BYL была коммерциализирована компанией LenioBio и продается под торговой маркой ALiCE. Объем лизата до 150 мл можно приготовить в течение нескольких часов путем выделения протопластов с последующим удалением вакуоли (которая содержит большую часть нуклеаз и протеаз, снижающих выход белков) центрифугированием плотности и окончательным механическим разрушением эвакуолированные протопласты (Buntru et al., 2015). Интересно, что система BYL содержит микросомы, везикулы, образованные в результате разрушения эндоплазматического ретикулума во время приготовления лизата.Следовательно, белки могут быть нацелены на микросомы путем включения N-концевых сигнальных пептидов, что делает возможным образование дисульфидных связей и эффективную укладку и сборку сложных и мультимерных функциональных белков, таких как ферменты, полноразмерные антитела и даже мембранные белки. Кроме того, нацеливание на микросомы делает возможным гликозилирование белка, связанного с N . Однако выяснение подробного гликанового паттерна все еще не выяснено. Бесклеточные платформы преимущественно используются в меньших масштабах (~ 50 мкл) для скрининга и оптимизации белков, но подготовка и масштабирование BYL просты и недороги, а бесклеточные реакции уже завершены на 6 мл. шкала.Таким образом, представляется возможным, что дальнейшее увеличение объема до 1–10 л позволит производить рекомбинантные белки в граммах, особенно те, которые трудно продуцировать в клеточных системах из-за их токсичности, нестабильности или несовместимости с внутриклеточными ферментами, такими как в виде киназ (Huck et al., 2017).

Рисунок 2 . Сравнение различных систем бесклеточной экспрессии эукариот с бесклеточным лизатом табака BY-2 (BYL). Указаны бесклеточные режимы реакции (сопряженная периодическая или непрерывная подача субстратов и удаление ингибирующих побочных продуктов диализом).Данные представляют собой самые высокие выходы белка, сообщенные для каждой системы, включая информацию о том, какой целевой белок был использован для определения максимальных уровней продукта, и взяты из следующих источников и информации компании: лизат ретикулоцитов кролика (RLL, люцифераза) (promega.de), дрожжевой экстракт Pichia pastoris (YeE, сывороточный альбумин человека) (Aw и Polizzi, 2018), экстракт клеток CHO (люцифераза) (Brodel et al., 2014), экстракт клеток насекомых Spodoptera frugiperda (ICE, прокаспаза 3) ( промега.de), экстракт клеток HeLa (HCE, модельный белок не указан) (thermofisher.com), экстракт зародышей пшеницы (WGE, модельный белок не указан) (biotechrabbit.com), экстракт Leishmania tarentolae (LTE, eGFP) (jenabioscience. com), HCEd (модельный белок не указан) (thermofisher.com), CHOd (слияние эпидермального фактора роста и eYFP) и WGEd (модельный белок не указан) (biotechrabbit.com) и BYL (eYFP).

Вызов очищения

Промышленные процессы экстракции и очистки рекомбинантных белков, продуцируемых клетками микробов и млекопитающих, хорошо отработаны, хотя последующая обработка по-прежнему является основным фактором общих затрат (Singh and Herzer, 2018).Извлечение белка особенно просто, когда продукты секретируются в культуральную среду клетками, растущими в суспензии, что обычно имеет место в случае клеток СНО. Таким образом, использование синтетической безбелковой среды для культивирования клеток СНО позволяет почти полностью избежать загрязнения продукта эндогенными белками клетки-хозяина (рис. 3С). Напротив, рекомбинантные белки, продуцируемые целыми растениями, должны быть извлечены из растительного материала, что требует удаления большого количества нерастворимых остатков и растворимых белков клеток-хозяев растений во время последующей обработки (рис. 3А).Даже когда рекомбинантные белки секретируются суспензионными культурами клеток растений, среда также содержит несколько секретируемых белков клетки-хозяина, что затрудняет очистку продукта (рис. 3В).

Рисунок 3 . SDS-PAGE анализ общих растворимых белков в экстрактах листьев N. benthamiana (A) , культуральной среде табака BY-2 (B) и культуральной среде CHO (C) без (слева) и с ( справа) секретируемое моноклональное антитело (100 мкг / мл).Указаны положения легкой цепи (LC) и тяжелой цепи (HC) антитела. M: предварительно окрашенный белковый маркер PageRuler.

Чтобы определить производственные затраты на процесс на основе растений, мы произвели человеческое полноразмерное антитело M12 (Kirchhoff et al., 2012) в растениях табака и очистили рекомбинантный белок из растительной матрицы. Мы вырастили 1440 трансгенных, гомозиготных T ₄ Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1 выращивали в теплице, и выход антител до очистки составлял 400 мкг / г свежей ткани листа (рис. 4).Присутствие сигнального пептида KDEL на С-конце тяжелой цепи вызывает накопление рекомбинантного антитела в эндоплазматическом ретикулуме. Мы собрали 200 кг листового материала через 8 недель после посева, и все растворимые белки были извлечены с использованием специально разработанной крупномасштабной технологической установки. Для удаления нерастворимого мусора растительный экстракт пропускали через последовательный каскад фильтрации, состоящий из начальной рукавной фильтрации с последующими тремя этапами глубинной фильтрации с размерами исключения 8, 1 и 0.3 мкм соответственно. Кроме того, осветленный растительный экстракт пропускали через модуль фильтра 0,2 мкм перед заполнением в одноразовые пакеты, используемые для хранения, чтобы избежать бактериального заражения. Антитело M12 очищали из осветленного растительного экстракта с использованием четырех стадий процесса, то есть хроматографии на протеине А, хроматографии CaptoAdhere, ультрафильтрации и окончательной диафильтрации. Чистота антитела в конечном элюате составила> 90%. Элюат с последней стадии фильтрации содержал 0.5–5,0 единиц / мл эндотоксина и немного остаточного протеина А (5–20 нг / мг IgG). Общий выход очищенного продукта составил 77 г, что соответствует довольно высокому извлечению 88% (фиг. 4). Общая стоимость процесса составила 87 550 евро, включая рабочую силу, расходные материалы и амортизацию инфраструктуры для выращивания растений и последующей обработки, а также всю необходимую аналитику, что эквивалентно 1137 евро за грамм очищенных антител.

Рисунок 4 . Затраты на производство и очистку человеческого антитела M12, продуцируемого трансгенными растениями табака в закрытой теплице.Продолжительность всего процесса от посева до анализа очищенного белка составила 10 недель. Мы обработали 200 кг листового материала, чтобы получить 77 г высокоочищенного антитела M12. FLW — масса свежих листьев; DSP, нисходящая обработка.

Системы на основе растений часто называют рентабельными из-за низкой стоимости выращивания в верхнем течении. Однако, как обсуждалось выше для антитела M12, на культивирование приходится только 16% общих затрат на процесс, тогда как последующая обработка составляет львиную долю этих затрат из-за усилий, необходимых для извлечения белка из внутриклеточной среды и удаления не только нерастворимых компонентов. растительного матрикса, но также и многие растворимые белки клетки-хозяина, которые высвобождаются вместе с продуктом во время гомогенизации.Извлечение того же антитела из культуральной среды клеток табака BY-2 потребовало гораздо меньше усилий, но последующая обработка, тем не менее, составила 77% от общих затрат на процесс (Raven et al., 2015). Продуктивность клеток BY-2 была в 20 раз ниже, чем у цельных растений табака, таким образом, стоимость товаров для очищенных антител была в 10 раз выше, чем для того же продукта, экстрагированного из цельных растений.

Низкая производственная площадь и высокая стоимость последующей обработки являются основными недостатками, ограничивающими коммерческое использование производственных систем на базе растений.Напротив, клетки CHO достигают высоких титров антител, и последующий процесс прост, снижая стоимость товаров до 200 долларов США / г (Lim et al., 2010), а в исключительных случаях — менее 25 долларов США / г (Kelley, 2007). Как обсуждалось выше, многие группы используют различные стратегии повышения урожайности белка в растениях, хотя и с ограниченным успехом (Twyman et al., 2013). Еще один многообещающий подход к повышению привлекательности производства на растительной основе — снижение затрат на последующую переработку, т.е.g. путем нагревания экстрактов растений для достижения быстрого и эффективного осаждения белков клетки-хозяина (Beiss et al., 2015) или путем разработки новых аффинных лигандов для повышения эффективности очистки (Ruhl et al., 2018). Производство на основе растений также может стать более конкурентоспособным за счет включения ценности побочных потоков биомассы, особенно для извлечения биоактивных растительных белков и малых молекул, или за счет использования остаточной биомассы для производства биогаза (Buyel, 2019).

Возможности для растительного производства

Хотя растения не могут конкурировать с микробами или клетками млекопитающих в большинстве процессов производства белка, они становятся гораздо более привлекательными в рыночных нишах, опираясь на одну или несколько из следующих уникальных характеристик:

▪ Улучшенная функциональность белка .Многие биофармацевтические препараты содержат гликанов, связанных с N , но растительные гликаны незначительно отличаются от гликанов человека, особенно остатки ядер β (1,2) -ксилозы и α (1,3) -фукозы, которые встречаются в растениях, но не в эндогенных гликопротеинах млекопитающих. Поэтому несколько исследований были сосредоточены на гуманизации гликановых цепей в растениях путем нейтрализации растительных гликозилтрансфераз и введения их человеческих аналогов, чтобы избежать каких-либо побочных реакций при введении пациентам биофармацевтических препаратов растительного происхождения (Montero-Morales and Steinkellner, 2018).Напротив, вакцины и некоторые биофармацевтические препараты для иммунотерапии рака могут получить пользу от растительных гликанов, потому что иммуногенность стимулирует активность антигенпрезентирующих клеток, в частности , через лектины или рецепторы маннозы / фукозы на поверхности дендритных клеток (Rosales-Mendoza et al. , 2016). Кроме того, некоторые терапевтические белки, несущие гликаны растительного происхождения, функционируют лучше, чем их нативные аналоги. Одним из примеров является Elelyso, рекомбинантная форма глюкоцереброзидазы человека, упомянутая выше.Он продуцируется в клетках моркови и направляется в вакуоль, поскольку гликаны, специфичные для вакуолей, улучшают поглощение белка макрофагами человека (Rup et al., 2017). Другим примером является производство растительных аллергенов, требующих надлежащего представления растительных гликанов, чтобы сделать возможным обнаружение антител IgE против детерминант перекрестно-реактивных углеводов растений.

▪ Матрица завода . Растения предлагают доступную стратегию производства вакцин для животных и терапевтических средств, особенно если их можно вводить местно или перорально, потому что это позволяет избежать дорогостоящей последующей обработки, снижая производственные затраты, чтобы сделать такие ветеринарные продукты гораздо более экономически конкурентоспособными.Пероральные вакцины и терапевтические средства можно вводить непосредственно в виде необработанных или минимально растительных тканей. Растительный матрикс может повышать эффективность вакцин и терапевтических средств, инкапсулируя их и защищая от переваривания, тем самым расширяя окно возможностей для воздействия на иммунную систему или клетки-мишени. В одном примере вакцину для домашней птицы, полученную в клетках суспензии табака, вводили в виде сырого экстракта цыплятам, чтобы защитить их от вируса болезни Ньюкасла (Schillberg et al., 2013). В другом примере горох, экспрессирующий паразитоспецифические антитела, вводили цыплятам для предотвращения желудочно-кишечного кокцидиоза (Zimmermann et al., 2009).

▪ Скорость производства . Системы временной экспрессии позволяют производить рекомбинантные белки в течение нескольких дней. Следовательно, это особенно подходит для производства аварийных вакцин (например, противогриппозных вакцин), которые необходимы в течение нескольких недель или месяцев после подтверждения последовательности гена.Переходную экспрессию легко масштабировать, выполняя процесс агроинфильтрации в больших вакуумных резервуарах для получения граммовых количеств конечного продукта (Spiegel et al., 2015).

▪ Приемка потребителей . Производство рекомбинантных белков в растениях также может улучшить восприятие конечного продукта. Это особенно актуально в случае косметических продуктов, поскольку растения считаются более естественными и экологически безопасными, чем клетки микробов и млекопитающих.Действительно, производство человеческого фактора роста в растениях ячменя (см. Выше) рекламируется с изображениями зеленых растений, растущих в теплице.

▪ Безживотное производство . Системы растений позволяют производить рекомбинантные белки без использования каких-либо реагентов животного происхождения, что требуется при производстве терапевтических средств и вакцин для некоторых религиозных общин, веганов или людей с аллергией на животных. Кроме того, выгодно производить диагностические белки, не загрязняя животные белки или эндотоксины, чтобы избежать вмешательства в тесты с клетками, тканями или органами млекопитающих.

Выводы и перспективы

Несмотря на низкую производительность, большие производственные площади и высокие затраты на последующую обработку по сравнению с традиционными платформами, заводами и растительными клетками, они обладают некоторыми уникальными преимуществами, которые делают их привлекательными для определенных продуктовых линий, таких как белки, требующие специфических для растений гликанов, ветеринарные препараты, средства экстренной помощи. вакцины и белки животного происхождения. Однако перевод многих из этих продуктов из исследований на рынок происходит медленно, что ограничивает видимость и коммерческое использование платформ на растительной основе для производства рекомбинантных белков.Коммерческий перевод для нетерапевтических белков проще и быстрее из-за меньшего нормативного бремени. Таким образом, эти продукты больше подходят для демонстрации экономической устойчивости производственных систем на основе растений. Напротив, терапевтические белки обещают более высокую рентабельность, но их коммерциализация требует всесторонних и дорогостоящих доклинических и клинических исследований при поддержке промышленных партнеров, предоставляющих опыт в разработке лекарств.Поэтому многие исследования, касающиеся производства терапевтических белков в растениях, никогда не выходят за рамки экспрессии, очистки и клеточного анализа. Прогресс в цепочке создания стоимости требует дополнительной работы, включая исследования токсичности, идентификацию биомаркеров для стратификации пациентов и терапевтического мониторинга, клинические испытания и принятие медицинскими страховыми и регулирующими органами. Дальнейшие коммерческие соображения включают интеллектуальную собственность / свободу управления портфелем, долю на рынке, потенциальных конкурентов и время выхода на рынок.Вывод на рынок большего количества биофармацевтических препаратов растительного происхождения потребует значительных инвестиций и более тесного сотрудничества с фармацевтической промышленностью, регулирующими органами и клиницистами. Важно отметить, что это имеет смысл только в том случае, если продукт предлагает уникальные преимущества с точки зрения качества, эффективности, масштаба / сроков производства и / или стоимости, когда он производится на растениях, а не на клетках СНО или микробах.

Доступность данных

Все наборы данных, созданные для этого исследования, включены в рукопись и / или дополнительные файлы.

Авторские взносы

Рукопись написана СС

. NR, HS, SR и MB отредактировали рукопись.

Финансирование

Некоторые из неопубликованных результатов, представленных здесь, были получены в рамках проекта CoMoFarm (227420), финансируемого ЕС, и проектов Phe-free 2 (FZK 031A587B) и бесклеточного биосинтеза (FKZ 0315942), финансируемых Федеральным министерством образования и исследований. (BMBF).

Заявление о конфликте интересов

SS является членом Научно-консультативного совета LenioBio GmbH, распространяющего платформу BYL, разработанную Fraunhofer IME и Dow AgroSciences.

Остальные авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим Наталью Яблоньку, Надю Вёпель (оба Fraunhofer IME, Аахен) и доктора Ивонн Мюк (metaX Institut für Diätetik, Фридберг, Германия) за помощь в производстве не содержащего фенилаланина белка в P. fluorescens (Simon Vogel Fraunhofer IME, Aachen) за помощь в работе с бесклеточной экспрессией, а также команду Fraunhofer IME за производство антитела M12 на растительной основе.Мы также благодарим доктора Ричарда М. Тваймана (Twyman Research Management Ltd., Скарборо, Великобритания) за редактирование рукописи. Авторы хотели бы поблагодарить членов консорциумов Pharma-Factory (774078) и Newcotiana (760331), финансируемых ЕС, за стимулирующие обсуждения проблем и бизнес-потенциала растений для производства рекомбинантных белков.

Сноски

Список литературы

Ав, Р., и Полицци, К. М. (2018). Конструирование с помощью биосенсора высокопроизводительной платформы для бесклеточного синтеза белка Pichia pastoris . Biotechnol. Bioeng. 116, 656–666. DOI: 10.1002 / бит. 26901

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Баешен, Н.А., Баешен, М.Н., Шейх, А., Бора, Р.С., Ахмед, М.М., Рамадан, Х.А., и др. (2014). Клеточные фабрики по производству инсулина. Microb. Фабрики клеток 13: 141. DOI: 10.1186 / s12934-014-0141-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бейс, В., Шпигель, Х., Боес, А., Капельски, С., Шойермайер, М., Edgue, G., et al. (2015). Тепловое осаждение позволяет эффективно очищать функциональный слитый белок-кандидат в вакцину, блокирующий передачу малярии, растительного происхождения. Biotechnol. Bioeng. 112, 1297–1305. DOI: 10.1002 / бит.25548

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бунтру М., Фогель С., Шпигель Х. и Шилберг С. (2014). Бесклеточный лизат табака BY-2: альтернативная и высокопродуктивная система трансляции in vitro на растительной основе . BMC Biotechnol. 14:37. DOI: 10.1186 / 1472-6750-14-37

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бунтру М., Фогель С., Стофф К., Шпигель Х. и Шилберг С. (2015). Универсальная связанная бесклеточная система транскрипции-трансляции на основе лизатов клеток табака BY-2. Biotechnol. Bioeng. 112, 867–878. DOI: 10.1002 / бит.25502

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Буйель, Дж. Ф. (2019). Интеграция растительного молекулярного земледелия и использование побочных потоков для достижения устойчивого биопроизводства. Фронт. Plant Sci. 9: 1893. DOI: 10.3389 / fpls.2018.01893

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Де Коза, Б., Моар, В., Ли, С. Б., Миллер, М., и Даниэлл, Х. (2001). Сверхэкспрессия оперона Bt cry2Aa2 в хлоропластах приводит к образованию инсектицидных кристаллов. Nat. Biotechnol. 19, 71–74. DOI: 10.1038 / 83559

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фишер Р., Дроссар Дж., Командор У., Шилберг, С., и Эманс, Н. (1999). К молекулярному сельскому хозяйству в будущем: переход от производства диагностических белков и антител в микробах к растениям. Biotechnol. Прил. Biochem. 30, 101–108.

Google Scholar

Фишер Р., Шилберг С., Буйель Дж. Ф. и Твайман Р. М. (2013). Коммерческие аспекты производства фармацевтического белка в растениях. Curr. Pharm. Des. 19, 5471–5477. DOI: 10.2174 / 1381612811319310002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фишер Р., Шилберг, С., Хеллвиг, С., Твайман, Р. М., и Дроссар, Дж. (2012). Вопросы GMP для рекомбинантных фармацевтических белков растительного происхождения. Biotechnol. Adv. 30, 434–439. DOI: 10.1016 / j.biotechadv.2011.08.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хансен, Х. Г., Пристовсек, Н., Кильдегаард, Х. Ф., и Ли, Г. М. (2017). Повышение секреторной способности клеток яичника китайского хомячка путем эктопической экспрессии эффекторных генов: извлеченные уроки и будущие направления. Biotechnol. Adv. 35, 64–76. DOI: 10.1016 / j.biotechadv.2016.11.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хаусманн, Р., Чудобова, И., Шпигель, Х., Шилберг, С. (2018). Протеомный анализ клеточных линий СНО, продуцирующих высокие и низкие количества рекомбинантных антител до и после селекции метотрексатом. J. Biotechnol. 265, 65–69. DOI: 10.1016 / j.jbiotec.2017.11.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хэвенит, Х., Kern, K., Rautenberger, P., Spiegel, H., Szardenings, M., Ueberham, E., et al. (2017). Комбинация двух методов идентификации эпитопов позволяет рационально сконструировать мутанты соевого аллергена Gly m 4. Biotechnol. J. 12: 1600441. DOI: 10.1002 / biot.201600441

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хэвенит, Х., Рэйвен, Н., Ди Фиоре, С., Фишер, Р., Шилберг, С. (2014). Анализ на основе изображений клеточно-специфической продуктивности для суспензионных культур клеток растений. Plant Cell Tissue Org. Культ. 117, 393–399. DOI: 10.1007 / s11240-014-0448-x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hoffmann, B., Jablonka, N., Rasche, S., Schillberg, S., and Mücke, Y. (2018). Новый рекомбинантный пищевой белок, содержащий специфическую полипептидную последовательность, полезный в качестве диетической композиции для лечения расстройства, имеющего накопление фенилаланина в организме, при котором расстройство представляет собой гиперфенилаланинемию, то есть фенилкетонурию . EP32

, WO2018041920.

Google Scholar

Худ, Э. Э., Ведьмак, Д. Р., Мэддок, С., Мейер, Т., Башчински, К., Бейли, М. и др. (1997). Коммерческое производство авидина из трансгенной кукурузы: характеристика трансформанта, производство, переработка, экстракция и очистка. Mol. Порода. 3, 291–306. DOI: 10.1023 / A: 1009676322162

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Huck, N.V, Leissing, F., Majovski, P., Buntru, M., Aretz, C., Flecken, M., et al. (2017).Комбинированное 15N-мечение и тандемMOAC позволяет количественно оценить фосфорилирование субстратов киназы MAP ниже MKK7 у Arabidopsis. Фронт. Plant Sci. 8: 2050. DOI: 10.3389 / fpls.2017.02050

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кирхгоф, Дж., Рэйвен, Н., Боес, А., Робертс, Дж. Л., Рассел, С., Треффенфельд, В. и др. (2012). Линии моноклональных клеток табака с повышенным выходом рекомбинантных белков могут быть получены из гетерогенных культур суспензий клеток путем сортировки в потоке. Plant Biotechnol. J. 10, 936–944. DOI: 10.1111 / j.1467-7652.2012.00722.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лим, Дж. А. С., Паткар, А., МакДонах, Г., Синклер, А., и Люси, П. (2010). Моделирование стоимости биопроцессов. BioProcess Int. 8, 62–70.

Google Scholar

Ма, Дж. К., Хиатт, А., Хейн, М., Вайн, Н. Д., Ван, Ф., Стабила, П. и др. (1995). Генерация и сборка секреторных антител в растениях. Наука 268, 716–719.DOI: 10.1126 / science.7732380

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мандал, М. К., Ахвари, Х., Шилберг, С., и Ширмейер, А. (2016). Борьба с нежелательным протеолизом у растений-хозяев, используемых для молекулярного земледелия. Фронт. Plant Sci. 7: 267. DOI: 10.3389 / fpls.2016.00267

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мариллонне, С., Терингер, К., Кандзия, Р., Климюк, В., Глеба, Ю. (2005).Системная трансфекция вирусных репликонов, опосредованная Agrobacterium tumefaciens , для эффективной временной экспрессии в растениях. Nat. Biotechnol. 23, 718–723. DOI: 10.1038 / nbt1094

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рынки и рынки (2017). Рынок экспрессии белка по типу ( E. coli , млекопитающие, дрожжи, Pichia, насекомые, бакуловирус, бесклеточный), продуктам (компетентные клетки, реагенты, инструменты, услуги), применению (терапевтическое, исследовательское, промышленное) и конечному пользователю — глобальный прогноз до 2022 г.Отчетный код BT 2435.

Google Scholar

Нельке Г., Фишер Р. и Шилберг С. (2003). Производство терапевтических антител в растениях. Эксперт. Opin. Биол. Ther. 3, 1153–1162. DOI: 10.1517 / 14712598.3.7.1153

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пуджар, Н., Лоу, Д., и О’Лири, Р. (2017). «Очистка антител: факторы изменений» в разделе «Очистка антител в масштабе процесса». изд. У. Готтшалк (Хобокен, Нью-Джерси: John Wiley & Sons, Inc.).

Google Scholar

Raven, N., Rasche, S., Kuehn, C., Anderlei, T., Klöckner, W., Schuster, F., et al. (2015). Расширенное производство рекомбинантных антител, продуцируемых растительными клетками, в 200-литровом одноразовом биореакторе с орбитальным встряхиванием. Biotechnol. Bioeng. 112, 308–321. DOI: 10.1002 / бит.25352

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Retallack, D. M., Jin, H., and Chew, L. (2012). Надежное производство белка в системе экспрессии Pseudomonas fluorescens . Protein Expr. Purif. 81, 157–165. DOI: 10.1016 / j.pep.2011.09.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ритакко, Ф. В., Ву, Ю., и Хетан, А. (2018). Среды для культивирования клеток для экспрессии рекомбинантного белка в клетках яичника китайского хомячка (СНО): история, ключевые компоненты и стратегии оптимизации. Biotechnol. Прог. 34, 1407–1426. DOI: 10.1002 / btpr.2706

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Росалес-Мендоса, С., Салазар-Гонсалес, Дж. А., Деккер, Э. Л., и Рески, Р. (2016). Роль растительных гликанов в разработке инновационных вакцин. Expert Rev. Vaccines 15, 915–925. DOI: 10.1586 / 14760584.2016.1155987

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Руль, К., Кнёдлер, М., Оппенштайнен, П., и Буйель, Дж. Ф. (2018). Линейный эпитоп, связанный с DsRed, обеспечивает аффинный лиганд для захвата моноклональных антител. J. Chromatogr. А 1571, 55–64.DOI: 10.1016 / j.chroma.2018.08.014

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Руп Б., Алон С., Амит-Коэн Б. К., Брилл Алмон Е., Черткофф Р. и Текоа Ю. (2017). Иммуногенность гликанов на биотерапевтических препаратах, продуцируемых в системах экспрессии растений. История талиглюцеразы альфа. PLoS One 12: e0186211. DOI: 10.1371 / journal.pone.0186211

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мешок, М., Радемахер, Т., Spiegel, H., Boes, A., Hellwig, S., Drossard, J., et al. (2015). От гена к урожаю: понимание восходящих процессов разработки GMP-производства моноклональных антител в трансгенных растениях табака. Plant Biotechnol. J. 13, 1094–1105. DOI: 10.1111 / pbi.12438

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Санчес-Гарсия, Л., Мартин, Л., Манг, Р., Феррер-Мираллес, Н., Васкес, Э., и Вильяверде, А. (2016). Рекомбинантные фармацевтические препараты из микробных клеток: обновление 2015 г. Microb. Сотовые фабрики 15:33. DOI: 10.1186 / s12934-016-0437-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ширмейер, А., Шинкель, Х., Апель, С., Фишер, Р., и Шилберг, С. (2005). Производство Desmodus rotundus слюнного активатора плазминогена альфа 1 (DSPA альфа 1) в табаке затруднено протеолизом. Biotechnol. Bioeng. 89, 848–858. DOI: 10.1002 / бит.20410

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шилберг, С., Рэйвен, Н., Фишер, Р., Твайман, Р. М., и Ширмейер, А. (2013). Молекулярное выращивание фармацевтических белков с использованием суспензионных культур клеток и тканей. Curr. Pharm. Des. 19, 5531–5542. DOI: 10.2174 / 1381612811319310008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сингх Н. и Херцер С. (2018). Технологии последующей обработки / улавливание и окончательная очистка: возможности для инноваций, изменений и улучшений. Обзор последующих разработок в области очистки белка. Adv. Biochem. Англ. Biotechnol. 165, 115–178. DOI: 10.1007 / 10_2017_12

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Spiegel, H., Boes, A., Voepel, N., Beiss, V., Edgue, G., Rademacher, T., et al. (2015). Применение масштабируемой платформы экспрессии преходящих генов растений для разработки вакцины против малярии. Фронт. Plant Sci. 6: 1169. DOI: 10.3389 / fpls.2015.01169

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Spiegel, H., Стегер, Э., Твайман, Р. М., и Буйель, Дж. Ф. (2018). «Текущее состояние и перспективы ландшафта молекулярного земледелия» в Молекулярный фарминг: приложения, проблемы и новые области. изд. А. Р. Кермод (Хобокен, Нью-Джерси: John Wiley & Sons, Inc.), 3–23.

Google Scholar

Твайман, Р. М., Шилберг, С., и Фишер, Р. (2013). Оптимизация выхода рекомбинантных фармацевтических белков в растениях. Curr. Pharm. Des. 19, 5486–5494. DOI: 10.2174/1381612811319310004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Твайман, Р. М., Стогер, Э., Шилберг, С., Кристу, П., и Фишер, Р. (2003). Молекулярное земледелие в растениях: системы хозяев и технология экспрессии. Trends Biotechnol. 21, 570–578. DOI: 10.1016 / j.tibtech.2003.10.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Васильев Н., Гремпинг У., Липпертс А., Равен Н., Фишер Р. и Шилберг С.(2013). Оптимизация культуральной среды суспензии клеток BY-2 для продукции человеческого антитела с использованием комбинации фракционных факторных планов и метода поверхности ответа. Plant Biotechnol. J. 11, 867–874. DOI: 10.1111 / pbi.12079

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Васильев, Н., Смалес, К. М., Шилберг, С., Фишер, Р., и Шилберг, А. (2016). Разработки в области производства антител слизистой оболочки растений. Biotechnol.Adv. 34, 77–87. DOI: 10.1016 / j.biotechadv.2015.11.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ямамото Т., Хосикава К., Эзура К., Окадзава Р., Фудзита С., Такаока М. и др. (2018). Улучшение системы временной экспрессии для продукции рекомбинантных белков в растениях. Sci. Отчет 8: 4755. DOI: 10.1038 / s41598-018-23024-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Циммерманн, Дж., Заальбах, И., Jahn, D., Giersberg, M., Haehnel, S., Wedel, J., et al. (2009). Антитела, экспрессирующие семена гороха, как корм для профилактики паразитарных инфекций желудочно-кишечного тракта у кур. BMC Biotechnol. 9:79. DOI: 10.1186 / 1472-6750-9-79

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зимран А., Гонсалес-Родригес Д. Э., Абрахамов А., Купер П. А., Варугезе С., Хиральдо П. и др. (2018). Долгосрочная безопасность и эффективность альфа-талиглюцеразы у педиатрических пациентов с болезнью Гоше, ранее не получавших лечения или получавших имиглюцеразу. Blood Cells Mol. Дис. 68, 163–172. DOI: 10.1016 / j.bcmd.2016.10.005

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Производственная система Toyota | Видение и философия | Компания

Происхождение производственной системы Toyota Производственная система, отлаженная из поколения в поколение

Корни производственной системы Toyota

Производственная система Toyota (TPS), основанная на философии полного устранения всех отходов в поисках наиболее эффективных методов, уходит корнями в автоматический ткацкий станок Сакичи Тойода. TPS развивалась в течение многих лет методом проб и ошибок, чтобы повысить эффективность на основе концепции Just-in-Time, разработанной Киичиро Тойода, основателем (и вторым президентом) Toyota Motor Corporation.

Отходы могут проявляться, среди прочего, в виде избыточных запасов, посторонних операций обработки и дефектных продуктов. Все эти «ненужные» элементы переплетаются друг с другом, создавая больше отходов, что в конечном итоге влияет на руководство самой корпорации.

Автоматический ткацкий станок, изобретенный Сакичи Тойодой, не только автоматизировал работу, которая раньше выполнялась вручную, но и встроил способность делать выводы в саму машину. Устраняя как дефектные продукты, так и связанные с ними расточительные методы, Sakichi удалось быстро повысить как производительность, так и эффективность работы.

Киичиро Тойода, унаследовавший эту философию, решил воплотить в жизнь свою веру в то, что «идеальные условия для производства вещей создаются, когда машины, оборудование и люди работают вместе, чтобы повысить ценность, не производя никаких отходов».