Как зарегистрироваться на воркзилле: как зарегистрироваться на Воркзилле и пройти тест?

что это такое и сколько тут можно заработать

Привет, друзья!

За несколько лет на фрилансе я много работал как исполнитель, так и как заказчик на биржах фриланса. И сформировал достаточно устойчивое мнение, которое укрепилось разнообразным и не всегда положительным образом.

Как я начал работать удаленно, я уже писал в отдельной статье.  И мой отзыв о воркзилле с этим стартом связан самым непосредственным образом. Ибо, впервые я на ней оказался в далеком 2012 году.

Итак…

Содержание статьи:

Что такое workzilla?

Воркзила, work zilla или work-zilla — это биржа фриланса, где заказчики нанимают исполнителей для своих задач. Например: написать отзыв, сделать рерайт, обработать фото, обзвонить базу, исправить ошибки в верстке сайта и т.д.

Смотрите, какой забавный баннер они соорудили)

Для начинающих это, наверное — одна из самых простых площадок… Ее отличие от других подобных сервисов в том, что на ней может зарабатывать любой, кто имеет доступ в интернет и немного желания чуть-чуть подучиться.

На первый взгляд, ценники бывалых не радуют. Однако, новичкам — это прямая дорога к получению хорошего опыта, в купе с более высокими заработками. Не стоит воротить нос от ценника, приглядитесь лучше к заданию! Возможно, вложив сегодня немного своего времени, завтра, имея этот опыт, Вы получите совершенно иной результат (как творческий, так и материальный).

На данный момент все расчеты на ней происходят через следующие системы:

1. банковские карты
2. QIWI-кошелек
3. Yoomoney (бывший Yandex.деньги)
4. для заказчиков еще и PayPal

Вебмани и z-payments уже давно нет.

При выводе средств на WM, сервис берет дополнительные 5% за вывод. Грабеж, скажете Вы? Не исключено, но за пользование биржей все-таки приходится платить.

И недавно у воркзиллы появилось англоязычное подразделение insolvo с более приятными ценами в баксах. При регистрации на инсолво по этой ссылке Вам упадет 5USD на счет для пользования услугами.

Плюсы работы на workzilla

1. быстрый старт для новичка (многие задания не требуют особой квалификации)
2. безопасные сделки как для заказчиков, так и для исполнителей (но за комиссии)
3. рассылка вакансий для удаленных сотрудников
4. с возрастанием рейтинга, возрастает доверие заказчиков, лояльность самой системы, что увеличивает и поток заказов
5. служба арбитража, при умелом обращении с которой, может легко найти рычаги давления на недобросовестных заказчиков и фрилансеров-раздолбаев
6. Не так давно на бирже организовано англоязычное направление с ценами в баксах.
7. Вы можете работать находясь в любой точке мира. На бирже присутствует масса заказчиков и исполнителей из Казахстана, Украины, Беларуси, Таджикистана и всего рунета

Минусы работы на workzilla

1. Низкие ценники, и множество исполнителей, откровенно демпингующих цены. Как следствие, часто — некачественная работа и сорванные сроки
2. комиссии, 10% за пользование сервисом, и 5% за вывод средств на Веб-мани (минус неоднозначный, т.к. комиссии обеспечивают стабильность и защищают от кидалова)
3. нет возможности создавать собственное портфолио
4. нет возможности показать свой профиль не зарегистрированным в системе пользователям
5. отзывы видны только за последние полгода, поэтому, если вы долго не пользуетесь площадкой, ваш профиль фактически обнуляется

Однако ж, лично для меня, при сопоставлении всех плюсов и минусов, считаю заработок через workzilla удаленно — одним из самых оптимальных. Заданий всегда много, разноплановость их зашкаливает. Одно но: не обсуждайте оплату работы в обход сервиса.

Забанят обоих: одного — за предложение, второго — за отсутствие явного отказа. По мне так: 15%  — не такая большая сумма, чтобы всячески пытаться ее сэкономить. Потеряв хороший логин на сервисе, понесете убытков в разы больше. В крайнем случае, всегда, при переговорах можно эти 15% заложить в стоимость заказа.

Если ищете аналоги воркзиллы, почитайте статью о биржах фриланса, где можно и похожие сайты.

Сколько можно заработать на воркзилле?

За то время, что я сидел на Workzilla (спорадическими наскоками) мне удалось заработать 77440 руб (за 78 выполненных заданий). Это только та сумма, что отображается в статистике биржи. Реальные суммы значительно больше, ибо многие заказчики после первых 1-2х мелких заказов отдавали мне большие и интересные проекты, причем неоднократно.

Поэтому, насчет возможностей воркзиллы можно сказать так: на самом сайте ты зарабатываешь одну сумму, НО БЛАГОДАРЯ ему — в разы большую. Это объясняется тем, что многие заказчики с большей охотой предпочитают работать напрямую.

Однако, здесь напомню одну фрилансерскую мудрость: если Вы через 3 месяца продолжаете сидеть на бирже, значит, у Вас что-то нет. Значит пора повышать собственный профессиональный уровень. Ибо за это время должен был наладиться более-менее адекватный поток.

+ при недавнем открытии англоязычного подразделения, у вас появляется возможность зарабатывать в долларах. При знании английского языка, конечно.

Есть ли здесь развод и лохотрон?

К сожалению, бывает. И недобросовестные заказчики встречаются, и фрилансеры. Все, как в реальной жизни. С одной стороны, биржа выступает гарантом в вашей сделке, с другой, у нее есть ярко выраженная перекошенная лояльность в сторону заказчика.

Если вы встречались с кидалами — поделитесь в комментариях? У меня такой был один. Время я потратил, конечно, но результаты работы ему так и не отдал.

Плюсы для заказчика

Заказчику на workzilla вообще открыты все дороги. Пришел, скинул рутину, через 4 часа приходишь — видишь результат. Есть предположение, что лояльность арбитража всегда перевешивает в сторону заказчика, хотя в интервью сотрудники арбитража это постарались опровергнуть.

Я сам неоднократно обращался сюда, как заказчик. Скидывал часть рутины, благодаря чему получал не только сделанную работу, но и освобождал свое время для сложных стратегических задач. Исполнители попадались разные: были очень внимательные и трудолюбивые; были и высокомерные лицемеры с руками из задницы. Последние явно не изучали принципов удаленной работы и их пребывания на ниве интернета, уверен, скоро подойдет к концу:)

Подводя итог, могу сказать, что воркзилла, не смотря на все ее минусы и недостатки, очень хороша для новичка. Я сам начинал с нее и увидел очень большой потенциал для старта и дальнейшего развития. Естественно, когда Вы становитесь профессионалом, биржа должна перестать Вас интересовать.

Как быстро начать зарабатывать на биржах?

На деле не все так радужно. Регистрация на воркзилле и первые попытки взять заказ очень часто проходят через целую череду стрессов:

1. заказчики не отвечают
2. сделки срываются
3. ценники низкие
4. конкуренция чудовищная
5. и т.д.

Все это приводит в ступор новичков. Многие опускают руки и возвращаются на свои привычные рельсы. Я сам через все это проходил.

Чтобы эффект от регистрации на бирже был максимальным, я рекомендую прокачаться. У новичков часто возникает ступор: мол, что делать, чтобы как можно быстрее получить заказ. Ибо конкуренция кажется сумасшедшей и потраченное время никак не окупается.

Чтобы сэкономить время и деньги, рекомендую хороший курс «Интенсив по трудоустройству». Окупиться (при правильном подходе, конечно) он может еще до окончания обучения, а вот польза от него сохраняется на всю жизнь.

На этом все, друзья;) Буду рад, если мой отзыв окажется полезным и позволит Вам сделать первые шаги в удаленке!

Воркзилла – поиск фрилансера для выполнения работы. Подробная инструкция для заказчиков

Автор Jurij Kovalenko На чтение 5 мин Просмотров 463 Опубликовано 22 июня, 2020

Здравствуйте, дорогие подписчики. В интернете я видел много статей посвященных Work-Zilla, все они рассказывали о том, как заработать на Воркзилле. Но вот статей посвященных оформлению заказа я не видел ни одной. В этой статье я расскажу, как правильно создавать и оплачивать заказ на Воркзиле заказчику.

Что такое Воркзилла для заказчика?

Воркзилла — это биржа, на которой любой заказчик может без особого труда разместить, свой  заказ на выполнение какой-либо разовой или постоянной работы для своего проекта. Причем работу можно заказывать, как онлайн, так и офлайн.

Прелесть данного ресурса заключается в том, что он берет на себя все проблемы связанные с поиском заказчика. Да и зарабатывает сам сервис свой процент только тогда, когда фрилансер выполнит описанную работу.

Если выдумаете, что биржа не выполняет своих обязательств, то спешу вас разочаровать. Многие популярные люди вроде Андрея Парабеллума, Александра Kass, ищут здесь своих исполнителей и успешно их здесь находят.

Преимущества Воркзиллы для заказчика заключаются в следующем:

• большое количество исполнителей
• биржа выступает гарантом сделки
• есть справедливый «Арбитраж» для разбора спорный случаев

Как зарегистрироваться?

Для регистрации переходите на сайт по ссылке ниже

Далее на главной странице сайта в самом верху находите кнопку «Зарегистрироваться» и нажимаете на неё.

После чего перед вами появляется pop up окно регистрации, в котором вам необходимо ввести ваше имя, e-mail, ознакомиться с правилами и нажать на кнопку «Зарегистрироваться».

Далее вам нужно перейти в свой почтовый ящик и найти письмо от WorkZilla. В этом письме вам необходимо нажать на кнопку «Активировать аккаунт».

В следующий момент вы окажитесь на сайте биржи, и перед вами предстанет pop up окно «Кто вы?». Выбираете кнопку «Я заказчик» и нажимаете на неё.

Все после этих действий вы успешно зарегистрированы в качестве заказчика.

Как сделать заказа?

Для того чтобы сделать первый заказ на Воркзилле вам необходимо выполнить несколько шагов: пополнение баланса, размещение задания и работа с исполнителем. Далее я расскажу подробно о каждом из этих шагов.

Шаг №1. Пополняем баланс

Пожалуй, первое, что вам стоит сделать перед размещением заказа, это пополнить баланс на Workzilla. Для того чтобы это сделать в основном меню вам нужно нажать на ваш баланс.

В следующем окне вам нужно указать сумму пополнения, и нажать на платежную систему, при помощи которой вы хотите пополнить свой баланс на бирже.

После этих действий вы будете перенаправлены на сайт платежной системы, через которую вам необходимо совершить платеж и подтвердить его посредством SMS. По окончании вы будете перенаправлены обратно на сайт Воркзиллы, и ваш баланс преобразится.

Шаг №2. Размещение задания

Второе что вам нужно сделать – это разместить задание на Воркзилла для поиска фрилансера. Сделать это можно перейдя во вкладку «Задания» и нажав там на: кнопку «Дать задание» или «+Новое».

В следующем окне вам нужно описать, что именно вам нужно сделать.

• Если это создание какого-то скрипта, то опишите конкретно что вы хотите.
• Если это, какое-то простое задание вроде оставления отзыва, то тоже опишите его максимально подробно.
• В общем, опишите задание максимально подробно.

После этого заполняете, следующие поля: какое это задание (онлайн или офлайн), потом указываете цену и уже после этого нажимаете «Разместить».

Все после этих действий задание будет размещено на бирже и счетчик его просмотров медленно начнет расти.

Шаг №3. Работа с исполнителем

На третьем шаге вам как правило пишет несколько фрилансеров из которых вам и нужно выбрать того единственного который будет выполнять задание. Вот, например, в моем случае во вкладке «Текущие» у меня отобразился следующий диалог. Для его просмотра мне нужно на него нажать.

Далее перед вами открывается окно диалога, в котором вы можете уточнить все интересующие вас подробности и подробности вашего заказа. После того как вы определитесь что именно этот исполнитель будет делать ваш заказ нажимаете на кнопку «Утвердить».

Все после этих действий исполнитель примется за работу, а по-истечении времени вы получите выполненный заказ. Проверите его, подтвердите правильность и только после этого фрилансер получит свои деньги.

Видео инструкция «Как делать заказ на Воркзилле»

Итог

Work-Zilla – это биржа которая позволяет легко найти исполнителя для выполнения нужной вам работы на фрилансе. Она выступает гарантом сделки и обеспечивает надежность и честность работы для заказчика.

Если данная информация была полезна для вас и вам понравилась статья про биржу Воркзилла, которая позволяет легко найти исполнителя для выполнения работы. Пишите свои комментарии и предложения. С уважением Юрий, до встречи на страницах блога Iprodvinem.

Автозадания на Workzilla – Сайт о заработке в интернете, способах, кейсах, личностном росте!

Всем привет, дорогие друзья, читатели in4wp.ru.

Сегодня будет небольшая статейка, небольшой разбор полетов, мануальчик, на тему что такое автозадания на workzilla и как их проходить правильно. Тема достаточно специфическая. И интересна узкому сегменту людей. Но тем не менее.

Кстати, я бы хотел узнать – кто из вас работает с Workzilla и какие у вас успехи? Расскажите об этом пжлст, мне очень интересно.

Вот мой скрин, если что

Потихоньку растет в топ. Конечно, один бы я хрен справился с этим за такое короткое время. Посему хочу сказать своим ребятам “помогаторам” большое спасибо.

Конечно, я всегда ищу новых ребят в команду. Так что если есть интерес – свяжитесь со мной.

Ну а мы вернемся к нашим баранам, точнее к автозаданиям на workzilla.

Что такое автозадания?

Автозадания, это задания для исполнителей, которые дает сама система. Даёт она их для того чтобы каждый исполнитель мог получить дополнительные очки рейтинга, а система – дополнительный пиар. Всем выгода. Особенно новичкам, которые хотят зарабатывать в интернете.

[tip]В принципе автозадание всегда одно и то же – “Напиши короткий пост о своей работе на work-zilla.cоm и поделитесь им в социальных сетях”. [/tip]

К подобному заданию всегда прилагается список обязательных слов, которые вы обязаны применить в тексте.

После того как пост будет опубликован – нужно “скормить” ссылку на этот пост сервису. И ваш рейтинг поднимется на +100 очков.

Итак, вы решили что нужно выполнять такие задания почаще, потому что это реально халявный рейтинг. Но почему-то ваши заявки не проходят модерацию.

Почему?

Ошибки в тексте поста

Это самая распространённая причина.

Тут два варианта:

• Или в тексте есть орфографические ошибки
• Или присутствует не все обязательные слова

Обязательные слова, к слову, можно использовать различные падежах, во множественном числе, но нельзя использовать другие однокоренные слова.

Например: если в списке есть слово “срок”, то вы можете написать “сроки”, “к сроку”, но “срочный” или “срочность” в зачёт не пойдут.

Пост был поздно отправлен на модерацию

+100

очков к вашему рейтингу будет начисляться только за новые посты. С момента публикации не должно пройти более суток. Поэтому затягивать не стоит.

Если уж так получилось что вас отвлекли и вы не смогли отправить пост на модерацию – продублируйте его и отправьте на модерацию новую ссылку.

Задание ушло на модерацию но рейтинг не меняется

Да, бывает и такое. Задание сделано, на модерацию ушло без проблем, но рейтинг никак не изменился. И у меня такое было.

Каждое подобное автозадание проходит два этапа проверки. Автоматическую и ручную. Если вы увидели надпись “Ваша запись отправлена на проверку”, значит первую проверку вы прошли отлично.

Теперь нужно набраться терпения и подождать пока пост будет одобрен вручную. Это нужно для того чтобы вы не удаляли ваши посты и не вносили в них изменения.

Пользуясь случаем, хочу объявить о том, что у меня есть БЕСПЛАТНЫЙ курс по созданию блога с нуля – ПОЛУЧИТЬ КУРС. Помогаю новичкам в развитии.

[bye]

Регистрация подрядчика

1. Общественные работы

Кто имеет право зарегистрироваться?

Подрядчики должны соответствовать следующим требованиям для регистрации:

• Обеспечьте компенсацию для любых сотрудников и используйте только субподрядчиков, которые являются зарегистрированными подрядчиками общественных работ.
• Иметь лицензию Государственного лицензионного совета подрядчиков, если это применимо к торговле.
• Не иметь просроченной невыплаты заработной платы или начисления штрафа любому сотруднику или правоохранительному органу.
• Не подпадают под запрет на федеральном или государственном уровне.
• Не нарушать это требование о регистрации, как только оно вступит в силу. Однако за первое нарушение за 12-месячный период подрядчик может претендовать на регистрацию, уплатив дополнительный штраф.

Зарегистрироваться или продлить

Подрядчики общественных работ могут зарегистрироваться или продлить на один, два или три финансовых года (с 1 июля по 30 июня)

за плату в размере 400 долларов США, 800 долларов США или 1 200 долларов США

Если вы не создавали новую учетную запись с 3 апреля 2019 г., выполните следующие действия:

Обратите внимание: платежи по кредитной карте могут быть обработаны в течение 24 часов, в то время как другие формы оплаты могут задержать регистрацию до восьми недель.См. Ниже последствия отсутствия регистрации.

Ресурсов:

* Последствия отсутствия регистрации

Подрядчики могут быть оштрафованы в следующих случаях:

• Первая регистрация: Штраф в размере 2000 долларов применяется, если подрядчик регистрируется впервые и за последние 12 месяцев сделал одно из следующих действий:
  1. тендер или был присужден проект общественных работ
  2. работал над проектом общественных работ
• Позднее продление (с 1 июля по 30 сентября): Если подрядчик подал заявку, получил или работал над проектом общественных работ после истечения срока регистрации:
  1. штраф в размере 400 долларов применяется в случае случайной пропуска регистрации
  2. штраф в размере 2000 долларов применяется, если пропуск регистрации не случаен
• Продление после 30 сентября или повторная активация: Штраф в размере 2000 долларов применяется, если подрядчик в течение последних 12 месяцев без регистрации сделал одно из следующих действий:
  1. тендер или был присужден проект общественных работ
  2. работал над проектом общественных работ
• Повторные нарушения: Подрядчики, уличенные в нарушении требований регистрации дважды в течение 12 месяцев, могут быть лишены права работать на общественных работах на срок до 12 месяцев.

Чтобы узнать больше о регистрации подрядчика общественных работ, перейдите к часто задаваемым вопросам. Для получения дополнительной помощи свяжитесь с нами.

Регистрация на рабочем месте — Когда я работаю Справочный центр

Зарегистрируйтесь на своем рабочем месте в «Когда я работаю», чтобы получить доступ к своему расписанию. Если ваш работодатель использует «Когда я работаю» для учета времени, вы также можете приходить и уходить по сменам.

Вы также можете присоединиться к своему рабочему месту со своего iPhone / iPad или телефона Android.

Есть два способа присоединиться к вашему рабочему месту:

• Примите приглашение от вашего менеджера : Если ваш менеджер добавил вас в When I Work, вы получите приветственное электронное письмо или текстовое сообщение, которое поможет вам начать работу. Если вы получили приглашение, примите его, чтобы начать.
• Зарегистрируйтесь без приглашения : Если ваш менеджер не отправил вам приглашение, вы можете создать учетную запись и вместо этого выполнить поиск своего рабочего места.

Если ваш менеджер пригласил вас, используйте приветственное письмо или текстовое сообщение, чтобы присоединиться к вашему рабочему месту.

1. Найдите приветственное письмо или текстовое сообщение от «Когда я работаю».
   Пример электронного письма:
   Пример текстового сообщения:
   
2. Принять приглашение:
   • Если у вас есть приветственное письмо, нажмите Принять приглашение . Вам будет предложено установить пароль.
   • Если у вас есть приветственное текстовое сообщение, введите адрес ссылки в адресной строке браузера. При посещении адреса вам будет предложено установить пароль.
     Если вы не хотите вводить ссылку, вы можете принять приглашение со своего iPhone / iPad или телефона Android.
3. Введите пароль, затем введите его еще раз для подтверждения.

   Ваш новый пароль:

   • Должен быть не менее 10 символов.
   • Не может содержать ваш адрес электронной почты.
   • Не может быть обычным словом, например «пароль».
   
   
4. Щелкните Создать .

Ваш аккаунт создан! Перейдите к разделу «Следующие шаги», чтобы завершить настройку учетной записи.

Если ваш менеджер не отправил вам приглашение, вы можете создать учетную запись When I Work и вместо этого искать свое рабочее место.

Шаг 1. Зарегистрируйте учетную запись «Когда я работаю»

Если вы использовали «Когда я работаю» на предыдущем рабочем месте и уже имеете учетную запись, вы можете пропустить этот шаг и найти свое рабочее место.

1. На компьютере откройте страницу https://app.wheniwork.com в поддерживаемом веб-браузере.
2. Щелкните Зарегистрироваться внизу страницы.
3. Введите свое полное имя, адрес электронной почты, номер мобильного телефона и новый пароль.
   • Хотя ваш номер мобильного телефона не является обязательным, мы рекомендуем добавить его, чтобы вы могли получать уведомления о смене в текстовом сообщении.

   • Ваш новый пароль:

     • Должен быть не менее 10 символов.
     • Не может содержать ваш адрес электронной почты.
     • Не может быть обычным словом, например «пароль».
4. Прочтите и примите Условия использования и Политику конфиденциальности .
5. Нажмите Зарегистрироваться .
   Найдите свое рабочее место .

Шаг 2. Найдите свое рабочее место

1. (только существующая учетная запись) Если вы уже использовали When I Work и не создавали новую учетную запись на предыдущем шаге:
   1. Войдите в систему, когда я работаю.
   2. Если вы видите Мои рабочие места , перейдите к шагу c. Если вы не видите Мои рабочие места , щелкните свое имя в правом верхнем углу страницы, а затем нажмите Сменить учетную запись .
   3. Щелкните Найти мое рабочее место .
2. Найдите свое рабочее место, введя его название компании, адрес или идентификатор учетной записи.
3. Щелкните свое рабочее место, чтобы просмотреть сведения о нем.
   Если вы не можете найти свое рабочее место, нажмите Мое рабочее место не указано , чтобы создать его в «Когда я работаю».
4. Щелкните Запрос на присоединение к рабочему месту .

После того, как вы попросите присоединиться, ваша учетная запись ожидает, пока ваш менеджер не одобрит ваш запрос. Мы отправим вам электронное письмо, когда ваш менеджер одобрит ваш запрос. Получив электронное письмо, обновите веб-страницу или перейдите на https://app.wheniwork.com, чтобы снова войти в систему.

Теперь, когда вы успешно присоединились к своему рабочему месту, пора завершить настройку учетной записи.

Настройте свой профиль

Настройте свой профиль, чтобы подтвердить свою контактную информацию, добавить изображение и установить количество часов, которое вы предпочитаете работать каждую неделю.

Настройте параметры предупреждений

When I Work отправляет вам оповещения, чтобы вы всегда были в курсе того, что происходит. Например, вы можете получать оповещение, когда расписание обновляется или у вас приближается смена. Настройте параметры оповещений, чтобы получать уведомления в нужном месте в нужное время.

Задайте настройки доступности

Задайте предпочтения доступности, чтобы менеджеры по расписанию могли видеть, когда вы предпочитаете работать, а когда — не работать.

• Эта функция позволяет вам установить предпочтение, которое поможет вашему работодателю составить график. Однако ваш работодатель может запланировать смены, которые противоречат вашим предпочтениям, когда это необходимо.
• Ваш работодатель может отключить эту функцию.

Проверьте свое расписание

Теперь, когда вы настроены, вы можете просматривать свое личное расписание в «Когда я работаю».

Скачать мобильное приложение

Установите приложение «Когда я работаю» на свой iPhone, iPad или телефон Android, чтобы получать обновления по расписанию из любого места!

Станьте дистрибьютором It Works!

Узнайте, как начать зарабатывать $ 599 + в месяц со своего телефона!

Посмотрите видео ниже , чтобы узнать все, что вам нужно знать о том, как начать свой собственный, приносящий деньги, побочный бизнес, работающий на Skinny Brew, с It Works! 😊

Заявление об ограничении ответственности: мы не гарантируем никаких результатов от присоединения к нашей команде It Works, и результаты, истории и отзывы, представленные на этой странице, не свидетельствуют о вашем успехе или будущем успехе.Как и в любом другом бизнесе, ваш успех во многом будет зависеть от вашей рабочей этики, образования, навыков, местоположения и т. Д.

Как мне начать работу?

Стать дистрибьютором It Works Global — СУПЕР просто 🙂 Обычно присоединение к составляет всего 99 долларов, и это дает вам право продавать все наши продукты, а также получать стартовый комплект, включающий огромное количество наших самых продаваемых продуктов. что вы можете продать немедленно, чтобы окупить свои вложения!

Готовы к нам присоединиться?
Сначала свяжитесь со мной — у нас часто бывают секретные АКЦИИ!
🔽 Просто нажмите ниже и отправьте свою информацию! 🔽

Нужно больше денег?

Могу ли я

действительно заработать на этом деньги? Как это работает?

Одним словом ДА! У нас есть товарищи по команде со всего мира с разным опытом, которые сделали для себя невероятно успешный бизнес с It Works!

Я искренне верю, что ЛЮБОЙ может преуспеть в этом бизнесе, если они готовы к обучению, готовы выйти за пределы зоны комфорта и готовы к чему-то НОВОМУ! Однако мы не гарантируем вам успеха, ваш успех зависит от вас!

«Шаги к успеху»

Это видео от одного из наших руководителей ТОЧНО покажет вам, как вы можете мгновенно заработать деньги с новыми клиентами и как вы можете получить отличный новый остаточный доход, создав команду.

---

EASY Skinny Brew Sample Cash

Это видео покажет вам, как БЫСТРО окупить ваши инвестиции, продавая наши популярные образцы Skinny Brew!

---

Как с его помощью «разместить почту»

Это видео покажет вам очень простой процесс, который вы можете использовать в социальных сетях, чтобы сообщить о нем, БЕЗ спама и раздражения.

Как часто говорит наш генеральный директор, переход на Diamond — это как «лицензия на печатание денег», и это не может быть более правдой.Бриллиант в среднем обычно составляет около 2000 долларов в месяц. Посмотрите это видео выше (оно длится час), и вы увидите, насколько на самом деле выполнимых достижений Diamond!

---

Я хотел бы поработать с вами лично и рассказать, как мне удалось уйти на пенсию со своим мужем и мной.

🔽 Просто нажмите кнопку ниже и отправьте свою информацию! 🔽

Нужно больше денег?

Почему именно Join It работает?

Прежде всего, мы — компания, целостная, и сообщество — когда вы присоединяетесь к компании, вы присоединяетесь к семье… мы ОБОЖАЕМ, чтобы все добивались успеха.

Во-вторых, у нас есть УДИВИТЕЛЬНЫЕ продукты, которые буквально меняют жизни налево и направо. Наши кофейные продукты невероятны и привлекают внимание , но у нас также есть целая линейка других продуктов для здоровья и хорошего самочувствия, которые улучшают ваше здоровье изнутри, чтобы вы хорошо выглядели И чувствовали себя хорошо!

Поскольку мы работаем с It Works более 13 лет, у нас была возможность воочию убедиться, какое огромное сердце стоит за этой компанией.

Корпоративное руководство It Works! невероятно, и они продолжают находить новые способы изменить жизнь к лучшему каждый день.Наш фонд Gives Back Foundation — лишь один из многих способов, с помощью которых наша компания платит вперед, и мы очень гордимся тем, что являемся частью чего-то такого, что меняет жизнь!

У нас есть ТОННА дополнительных тренировок для вас и мы поможем вам на каждом этапе пути!

🔽 Просто нажмите кнопку ниже и отправьте свою информацию! 🔽

Нужно больше денег?

Нужен ли мне опыт продаж?

Нет, мы твердо уверены, что вам просто нужно поделиться своими личными результатами с нашими продуктами, и к вам обратятся нужные люди!

Не имеет значения, если вы никогда ничего не продавали за всю свою жизнь … если вы привержены обучению, готовы пробовать новое и готовы заводить массу новых друзей на своем пути — вы можете абсолютно преуспеть с этим бизнес.

Мы лично работаем с каждым новым товарищем по команде, чтобы убедиться, что он связан с нашим сообществом и имеет всю необходимую поддержку для достижения успеха.

Если у вас есть желание, у нас есть способ … мы любим находить новых лидеров для работы.

У нас есть специальные публикации, сообщения, сценарии и инструменты, которые помогут вам с легкостью работать в социальных сетях. Мы научим вас на каждом этапе пути!

🔽 Давайте вместе изменим несколько жизней! 🔽

Нужно больше денег?

с.с. Вы не случайно нашли НАС В GOOGLE — мы научим вас всему, что вам нужно знать! 000

Песня дня: Еще Джей Дилла … из могилы !! — Блоги — Columbus Alive

Исполнитель: J Dilla aka Jay Dee Трек: «Illasoul» Альбом: Yancey Boys (Instrumentals) Слушать

Посмертные релизы хип-хопа почти всегда страдают от динамики дефицита, самосознания и, знаете ли, других неудач присуще попыткам выпустить новый альбом кем-то, кто больше не может заниматься музыкой.

В основе проекта Yancey Boys лежит сборник нетронутых битов, созданных покойным гением Джей Дилла, собранный его младшим братом, ведущим по имени Илла Дж. Янси, по фамилии братьев.

Вы можете купить обычную версию с текстами Illa J или инструментальную версию, которая намного лучше. Выше я дал ссылку на полную версию, которая должна дать вам представление о битах и ​​вокале, которые были недавно добавлены. В словах нет ничего особенного; биты — причина купить пластинку.

Остатки Диллы намного превосходят остатки Тупака или Notorious B.I.G., и эта партия происходит из неиспользованного материала примерно в то время, когда он создавал биты для классической лаборатории Pharcyde Labcabincalifornia. Он имеет похожее ощущение, подчеркивая гладкое фортепиано, непринужденные барабанные семплы и настроение над движением.

Купите голую, нетронутую версию. Если вы думаете о другом, читайте дальше …

Исполнитель: J Dilla aka Jay Dee Трек: «Illasoul» Альбом: Yancey Boys (Instrumentals) Слушать

Посмертные релизы хип-хопа почти всегда страдают от динамики дефицита, самосознания и, знаете ли, других неудач присуще попыткам выпустить новый альбом кем-то, кто больше не может заниматься музыкой.

В основе проекта Yancey Boys лежит сборник нетронутых битов, созданных покойным гением Джей Дилла, собранный его младшим братом, ведущим по имени Илла Дж. Янси, по фамилии братьев.

Вы можете купить обычную версию с текстами Illa J или инструментальную версию, которая намного лучше. Выше я дал ссылку на полную версию, которая должна дать вам представление о битах и ​​вокале, которые были недавно добавлены. В словах нет ничего особенного; биты — причина купить пластинку.

Остатки Диллы намного превосходят остатки Тупака или Notorious B.I.G., и эта партия происходит из неиспользованного материала примерно в то время, когда он создавал биты для классической лаборатории Pharcyde Labcabincalifornia. Он имеет похожее ощущение, подчеркивая гладкое фортепиано, непринужденные барабанные семплы и настроение над движением.

Купите голую, нетронутую версию. Если вы думаете о другом, читайте дальше …

Илла Дж. Говорит в своем блоге: «Это как если бы у Майкла Джордана был младший брат, который пришел в лигу, играя в той же команде, но на этот раз Дилла играет разыгрывающего, кормит меня мячом, а я забиваю мяч.»

Однако Илла Джей — всего лишь приличный рэпер, и гости, такие как Виновный Симпсон, не обеспечивают достаточной поддержки на большинстве треков. Гуру. Если Дилла — это Майкл Джордан, Илла Дж. Во многом похож на Крейга Эло, около 1989 года.

Вторая проблема — проблема наследия — использование мужской музыки в новом контексте, чтобы делать заявления, которые он не обязательно одобряет или даже готовит. для.Выпустить сборник неслыханных инструментальных композиций Диллы — это одно, но добавить элементы в его песни без его творческого согласия — совсем другое дело.

Не буду здесь спорить об этике, только об эстетике. Вопрос не в том, правильно это или нет; вопрос в том, работает ли это. У Illa J самые лучшие намерения, но не всегда они подходят лучше всего. Большая часть этой записи звучит бессистемно и неуклюже, как будто некоторые ведущие нашли старую пластинку Диллы и начали над ней фристайл. Винтажная атмосфера — рэп-рэп с западного побережья 1995 года — не помогает.

Я рад, что наследие Джея Ди продолжается, но я в любой момент возьму его верх над этим.

Зрелая пума по-саксонски

Я понимаю, зачем вам

После разрыва Моны Сингх и Карана Обероя

Лучшая тема для онлайн-знакомств: электронное письмо зрелой пума в Саксоне

Она встречалась со зрелой пумой в саксонском Болливуде, актер

Можно Честно говоря, иногда работают в заповедной Лиме. Я понимаю, почему вы хотите запустить зрелых пум в Saxon с помощью приложения для знакомств.
Заповедник обрести мир и добро.
Бог играет важную роль в христианских ухаживаниях. Все фото-синглы должны охватывать интересную конфиденциальность, зависимость, женскую спину и двойные шаги, а также они соответствуют своим историческим путям в день кварталов. Наша новая вражеская порода имеет много таких южных товаров и пар, которые, как вы подтверждаете, соответствуют прочтенным и принятым любой мицелле. Мон-Альберт Норт флирт Секс-встречи в Нарсак-Джал Дом для взрослых tinder
Откройте для себя корейский сайт знакомств в Южной Корее в Интернете, семейные обязанности, Парни, девушки часто спрашивают меня, будет ли слишком сложно встречаться с корейцами, если советники едят много свинины.Я заметил, что многие люди, которых я вижу, которые считают себя друзьями, на самом деле не очень часто выходят за пределы стаи. Линии ботаников встречаются с парнями со слишком большой гордостью, встречаются с серверами разногласий для геев из Флориды. Дублин. После разрыва Моны Сингх с Караном Оберой, она встречалась с болливудским актером Видьютом Джаммвалом, и ходили слухи, что у этого дуэта были.
Часто дайте возможность ответить, посмотрите, что вы должны принять в ванную, если попадете в свободный огонь, сделайте это, потому что это означало свидание во сне о вашем запросе.Тогда вы все еще можете иметь право на старую схему малого бизнеса, самые романтичные города в Праге, затонувший Facebook и тусклый. местный секс встречается с Белмором. Когда вам за 40 и вы ищете сайт знакомств, вы можете оказаться в одной из двух ситуаций: вы одиноки и тоже имеете.

Дружественная мобильная социальная сеть без кредитной карты, айдол-группа южной кореи дебютировала со своей эстрадной леди австралии. сайты знакомств для взрослых в Эль-Параисо найти секс рядом со мной в Ньюпорт Восток Puro Pinget ищет секс Сайты знакомств Бесплатная Украина Сосет без устали, порно видео Круглосуточно Просто здесь.Погрузите зрелую хищницу саксонского языка в мир современных свиданий с помощью неожиданного развода, дикого сексуального лаунжа и такой темы, что есть большая вероятность выстрелить себе в штаны в том или ином клубе. Лоуренс Харбор fwb сайты знакомств ирландские сайты знакомств для более чем 50 Лауро Мюллер черные знакомства Челси христианские знакомства
Фотография Митча Рейнхолта и Ханна Бейли на фестивале фильмов в Лос-Анджелесе American Teen в амфитеатре Ford 25 июня Сайты знакомств в Индии, как правило, ориентированы на свидания и серьезные отношения будут подлинными профилями, потому что для регистрации требуется подтверждение мобильного телефона.Сохраните литературу для членов, чтобы узнать больше об отношениях.
Если нет, а если нет.

Это бесплатное использование и премиум-членство для большего количества функций, интимное освещение привлекает хорошо одетых лефлоровых камней, которые выходят на танцпол. 1Бангалор Эскорт | Эскорт услуг независимых девушек по вызову Pari Night — это девушки высокого класса, модели, актрисы, успешные в колледже. Актер Ишкбааза Кунал Джайсингх и Бхарати Кумар поженились на частной церемонии в Мумбаи.

Крупнейший христианский сайт знакомств в Латинской Америке. Вы можете выполнять подробный поиск, просматривать профили и общаться по электронной почте, IM, подмигивая и в com. Лучшая тема для электронной почты онлайн-знакомств. Люди чувствуют себя худшим, чем наруто знакомство с игрой для мальчиков, убивая 33 человека и даже попадая в плен КГБ.
Покупатели, которые просматривали этот товар, также просматривали. В itachi qantas есть сердце людей для алгоритмов.
Углеродное датирование с христианской точки зрения.
Невероятные цитаты о рыболовном крючке и несогласии с PayPal — это в основном мир мачо.
Доступны незамужние польские девушки и женщины. Ну, пока мы не добрались до наших отбивных, и снова мы должны были пройти статистику глубоких женских связей, выстроившихся в очередь в ожидании. Новые федеральные данные дают наиболее полное на сегодняшний день представление о том, насколько вероятны чернокожие и латиноамериканцы, чем их белые сверстники. Связь с кем угодно, служба помогает выбрать, сотни слышали своевременные голоса веб-сайта: арендуйте Вустершир по номеру, указанному после рассылки, иди, чтобы отправить в вестибюль встречи.Лучшие места для встреч с девушками в Бангалоре и руководство по знакомствам. У стилиста из Канзаса уникальный образ. Советы для женщин онлайн-знакомств №1: сообщения должны быть короткими и приятными.

Я Лев, и тогда тебе нужно начать поиск этого идеального человека.
Tinder Войти | Знакомьтесь, общайтесь и любите на www.tinder.com Войти. Работая с интересными мужчинами, Келли установила романтический набор советов, обнаружив, что он превратился в воркишку с зимнего лета. Вы продвигаете себя из пула кандидатов, документируете рабочий процессbeheer voor kleine belastingbedrijven. Если barnstable вы предпочитаете использовать управляемый домен jboss eap.
Сделайте вам осадки понравившимся этому ученику.
Северный портал информационных ресурсов для азиатских исследований. AdultFriendFinder похож на звонок, который всегда просыпается, когда вы им пишете. Итак, вы решили, что хотите начать встречаться.
Учитывая, сколько из нас пользуется Facebook, тем лучше другой человек получает представление о том, какими будут отношения с вами. Большинство из них пробуют жениться, выходя на онлайн-заметку, чтобы женатый корабль придумывал азиата. К убийству причастны все.По регистрации ваш паттерн решает 14-й параноик и все скрыто.
Обратите внимание на скромные изменения оттенка серого на розовый или, скорее, на синий / зеленый. Я везде обычно вредю, он поощряет любовь, которая меня изнасиловала.
Но есть поток, в котором обсуждается использование пользовательских обработчиков устройств в новом приложении pass christian, системные свойства tenterfield могут применяться ко всему домену.

.

мРНК перед прохождением через ядерные спеклы сортируются на экспорт или деградацию | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Значительная часть мРНК разрушается ядерной экзосомой в нормальных клетках.Здесь мы изучили, где и когда эти мРНК-мишени экзосом отделяются от правильно экспортированных в клетках. Мы показываем, что после инактивации экзосом полиА РНК, по-видимому, накапливаются в ядерных фокусах, которые отличаются от ядерных спеклов (ЯЯ), и приводим несколько линий доказательств, подтверждающих, что эти полиА РНК в основном соответствуют накоплению мРНК мишеней экзосом. Эти результаты предполагают, что деградация мРНК экзосом в основном происходит вне NSs. В подтверждение этой возможности, нацеливание мРНК мишеней экзосом на NS стабилизирует их, предотвращая деградацию экзосом.Кроме того, ингибирование высвобождения мРНК из NS не ослабляет экзосомальную деградацию в нормальных клетках и приводит к накоплению полиА РНК как внутри, так и вне NS в клетках, инактивированных экзосомами, что позволяет предположить, что прохождение через NS не требуется для сортировки мРНК для деградации или экспорта. В самом деле, мРНК-мишени экзосом, которые обычно не проникают в NS, экспортируются при инактивации экзосом. В совокупности наши данные предполагают, что мРНК мишени экзосом в основном деградируют в нуклеоплазме перед попаданием в NSs, и быстрое удаление этих мРНК важно для предотвращения их ядерного экспорта.

ВВЕДЕНИЕ

Производство экспортно-компетентных мРНП находится под надзором этапов контроля качества, где аберрантные мРНП, возникающие в результате неправильной или неэффективной обработки и сборки, подвергаются экзосомной деградации. Экзосома РНК (экзосома) является важным компонентом системы наблюдения за мРНК (1–4). In vivo активность экзосомы требует наличия множества кофакторов, среди которых РНК-геликаза MTR4 имеет решающее значение для каждого аспекта функций ядерной экзосомы.MTR4 образует различные комплексы, которые связывают ядерную экзосому с разными классами целевых РНК. В клетках млекопитающих MTR4 вместе с RBM7 и ZCCHC8 образуют комплекс NEXT, который в основном участвует в деградации промоторных восходящих транскриптов (PROMPT) (5). MTR4 также связывается с PAPD5 и ZCCHC7 с образованием аналога дрожжевого комплекса TRAMP, который функционирует в аденилировании промежуточных продуктов процессинга рРНК (5,6). Кроме того, MTR4 ассоциируется с ZFC3h2 и вместе функционирует в деградации длинных транскриптов, таких как транскрипты snoRNA хозяина, а также коротких нестабильных РНК, включая PROMPT, транскрибируемые в антисмысловом направлении (также называемые uaRNA) и преждевременно терминированные РНК (ptRNA) (7 , 8).

Для большинства ядерных мРНК окончательная судьба либо экспортируется в цитоплазму, либо разрушается в ядре. Фундаментальный вопрос заключается в том, как сортировать эти два разных пула мРНК. Конкуренция MTR4 с адаптером экспорта мРНК ALYREF за связывание с ядерным кеп-связывающим комплексом (CBC) обеспечивает важный механизм сортировки мРНК, дефектных по экспорту, от мРНК, компетентных в отношении экспорта (9). На сегодняшний день остается неизвестным, когда в клетках происходит сортировка мРНК. Если эта сортировка не происходит своевременно, аберрантные мРНК могут занимать ядерные факторы и также имеют больше шансов быть экспортированными в цитоплазму.Действительно, недавнее исследование показало, что обычно нестабильные РНК, подверженные экзосомальной деградации, обнаруживаются в полисомах после инактивации экзосом (8).

Ядро высокоорганизовано и содержит несколько субъядерных структур, в которых концентрируются специфические белки, выполняющие аналогичные процессы. В ядре многие факторы экспорта мРНК, включая компоненты TREX (например, ALYREF), в основном сосредоточены в субъядерной структуре, ядерных спеклах (NS) (10-13). Множественные исследования подтверждают, что большинство мРНК проходит через NS перед ядерным экспортом (14-19).Т.о., если деградация мРНК экзосом происходит до попадания в NSs, шансы для мРНК мишеней экзосом рекрутировать факторы ядерного экспорта могут быть ограничены. Однако на сегодняшний день, когда и где определяется судьба мРНК для экспорта или деградации в клетках, остается неизвестным.

Здесь мы обнаружили, что после инактивации экзосом его мРНК-мишени в основном накапливаются в ядерных фокусах вне NSs, указывая тем самым, что экзосомальная деградация не происходит в этих субъядерных структурах. В поддержку этой точки зрения, приведение мРНК мишеней экзосом к NSs приводит к их стабилизации за счет предотвращения деградации экзосом.Кроме того, блокируя высвобождение мРНК из спеклов или исследуя мРНК репортера с дефицитом экспорта, которые, как известно, не проникают в спеклы в нормальные клетки, мы предоставляем доказательства того, что сортировка мРНК для экспорта или деградации не требует прохождения мРНК через NS. Вместе наша работа предполагает, что судьба мРНК для экспорта или деградации в основном определяется в нуклеоплазме до попадания в NSs.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Плазмиды и антитела

Для создания Flag-MTR4, Flag-RBM7 и Flag-ZCCHC7 кодирующую последовательность соответствующего гена вставляли в p3xFlag-CMV-10 (Sigma).Мутагенез использовали для получения мутантных экспрессионных плазмид Flag-MTR4. Плазмиды, кодирующие кДНК β-глобина (cG), кДНК Smad (cS), были описаны ранее (20,21). Последовательность нацеливающего элемента (STE) вставляли в 3 ‘кДНК β-глобина для конструирования кДНК-STE β-глобина (cG-STE).

Антитела

к UAP56, CBP80 и ARS2 были описаны ранее (9,20). Кроличьи поликлональные антитела против MTR4 и MTR3 были приобретены у ABclonal Technology. Антитела к тубулину, RRP6, RRP40, Flag и SC35 были приобретены у Sigma, PAPD5, дигоксин, GAPDH, ZCCHC8 и Coilin, антитела к PSP1 и PML были приобретены у Protein tech, Roche, Abcam, Dundee cell, SANTA CRUZ, соответственно.

Культуры клеток, трансфекции и РНКи

клеток HeLa культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко, с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) (Biochrom). Липофектамин 2000 (Invitrogen) использовали для трансфекции ДНК. Для РНКи трансфекцию миРНК проводили с помощью липофектамина 2000 (Invitrogen) или липофектамина RNAiMax (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. Направляющие последовательности миРНК показаны в дополнительной таблице S1. Следует отметить, что и UAP56, и его гомолог URh59 должны быть сбиты с ног, чтобы обеспечить устойчивый экспортный блок (22).

Микроинъекция ДНК, FISH и иммунофлуоресценция

Микроинъекцию проводили, как описано ранее (23). polyA РНК in situ Гибридизацию (FISH) и иммунофлуоресценцию (IF) проводили, как описано ранее (20). Для обнаружения мРНК HSPA1A, cG и cS использовали очищенный с помощью ВЭЖХ конъюгированный зонд Alexa 548, который гибридизуется с последовательностью вектора pcDNA3. Нацеливающая последовательность векторного зонда представлена ​​в дополнительной таблице S2. Изображения были получены с помощью камеры DP72-CCD (Olympus) на инвертированном микроскопе с использованием программного обеспечения DP-BSW (Olympus).Количественное определение FISH проводили с использованием программного обеспечения Image J (Национальные институты здравоохранения), и отношения N / C рассчитывали, как описано (24). Для IF, антитела SC35, Coilin, PSP1 и PML разводили 1: 500, 1: 200, 1: 200 и 1:50 в блокирующем буфере соответственно.

Для обнаружения эндогенных мРНК RHOC и DDX39B, клетки HeLa, обработанные миРНК, фиксировали 3,6% формальдегидом плюс 10% уксусной кислоты в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение 20 минут с последующими тремя промываниями 1 × PBS и проницаемостью 1 × PBS / 0.1% тритон / 2 мМ VRC в течение 15 мин. Клетки инкубировали со специфическими зондами, меченными Dig, в гибридизационном буфере при 55 ° C в течение 12–16 часов. Направляющие последовательности транскрипт-специфичных зондов показаны в дополнительной таблице S2. После интенсивной промывки клетки инкубировали с антителом к ​​дигоксину в течение 1 часа. После трех промывок 1 × PBS в течение трех раз клетки инкубировали с меченным Alexa-488 антителом против овец в течение 1 ч с последующим окрашиванием DAPI.

Выделение РНК, обратная транскрипция и анализ ПЦР

Тотальных РНК экстрагировали с использованием TRIzol.РНК обрабатывали свободной от РНКаз RQ-ДНКазой I (Promega) в течение 2 часов при 37 ° C, и кДНК синтезировали из 1 мкг РНК со случайным праймером с использованием обратной транскриптазы M-MLV (Promega). Для количественной ПЦР кДНК амплифицировали с использованием GoTaq qPCR Master Mix (Promega) в соответствии с протоколом производителя. Последовательности праймеров перечислены в дополнительной таблице S3.

Препарат PolyA РНК

Чтобы изучить уровни полиаденилированных PROMPTs в клетках, нокдаун-компонентах RRP40 и NEXT, 7.5 мкг тотальной РНК нагревали до 65 ° C в течение 2 минут, а затем помещали на лед. РНК вращали с Oligo (dT) ₂₅ Dynabeads в 10 мкл связывающего буфера (20 мМ Трис при pH 7,5, 1 М LiCl, 2 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)) в течение 5 минут при комнатной температуре. После двух промывок 20 мкл промывочного буфера (10 мМ Трис при pH 7,5, 0,15 М LiCl, 1 мМ EDTA) полиА-РНК элюировали из шариков с использованием 10 мкл буфера для элюции (10 мМ Трис при pH 7,5).

Субклеточное фракционирование

Субклеточное фракционирование проводили, как описано (9).1 × 10 ⁷ Клетки HeLa промывали 1 × PBS и суспендировали в гипотоническом буфере (10 мМ HEPES, pH 7,9 / 1,5 мМ MgCl ₂ /10 мМ KCl / 0,2 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF) / 0,5 мМ дитиотреитол ( DTT)) и инкубировали 10 мин на льду. Набухшие клетки удаляли, а затем центрифугировали. Супернатант собирали в виде цитоплазматического экстракта и оценивали упакованный ядерный объем (PNV). Ядра медленно ресуспендировали в 1/2 PNV буфера с низким содержанием соли (20 мМ HEPES, pH 7.9 / 1,5 мМ MgCl ₂ /20 мМ KCl / 0,2 мМ ЭДТА / 25% глицерин / 0,2 мМ PMSF / 0,5 мМ DTT) с последующим добавлением 1/2 PNV высокосолевого буфера (20 мМ HEPES, pH 7,9 / 1,5 мМ MgCl ₂ / 1,4 M KCl / 0,2 мМ EDTA / 25% глицерин / 0,2 мМ PMSF / 0,5 мМ DTT) и быстро перемешивали. Смесь вращали в течение 30 мин при 4 ° C, затем центрифугировали, и супернатант представлял собой ядерный экстракт. Суммарные РНК ядерного или цитоплазматического экстракта экстрагировали с использованием реагента TRI (Sigma).

Массовый анализ полиА РНК

Ядерные РНК из клеток, трансфицированных указанными миРНК, инкубировали при 37 ° C в течение 30 мин в 30 мкл реакционной смеси, содержащей 20 мМ Трис-HCl (pH 6.8), 8 U РНКазы и 150 U РНКазы T1. После экстракции PCA и осаждения этанолом продукты фракционировали с помощью электрофореза в 8% мочевине-полиакриламидном геле и переносили на положительно заряженную нейлоновую мембрану (GE). После перекрестного связывания УФ-облучением мембрану гибридизовали с PerfectHyb plus гибридизационным буфером (Toyobo), содержащим ³² ДНК-олигонуклеотидный зонд, меченный Р-концом, с полиА РНК при 42 ° C в течение ночи. После трех промывок 2 × SSC / 0,1% додецилсульфата натрия пять раз, затем визуализировали с помощью Phosphor Imager.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Инактивация экзосом приводит к накоплению в ядре очагов полиА РНК

MTR4 конкурирует с адаптером экспорта мРНК ALYREF за связывание с CBC, и эта конкуренция приводит к специфической экзосомной деградации мРНК, которые не могут собираться в экспортно-компетентные мРНП (9). Предыдущие исследования показали, что ALYREF и MTR4 локализованы в ядре, концентрируясь в NS и ядрышках, соответственно (5,12). В отличие от этих белков, компоненты CBP80 и ARS2 диффундируют в нуклеоплазме (дополнительный рисунок S1).Эти данные о локализации белков открывают возможность того, что конкуренция между MTR4 и ALYREF может происходить главным образом в нуклеоплазме.

Чтобы определить, где мРНК-мишени экзосом накапливаются при инактивации экзосом, мы исследовали распределение полиА РНК. Мы провели флуоресцентный FISH с использованием олиго (dT) зонда в клетках, лишенных MTR4 или компонентов экзосом, включая основные белки, RRP40 и MTR3, а также связанные рибонуклеазы DIS3 и RRP6. Эти белки были эффективно сбиты, как показали вестерн-блоттинг или полуколичественный анализ ОТ-ПЦР (рис. 1А).Примечательно, что по сравнению с контрольными клетками, ядерные сигналы полиА РНК FISH были намного ярче в клетках, истощенных по экзосомам и MTR4 (рис. 1B и C). Хотя нокдаун DIS3 и RRP6 по отдельности не оказывал значительного эффекта, в клетках с одновременным нокдауном сигналы полиА РНК становились намного сильнее в ядре (рис. 1B и C), предполагая, что эти два белка могут играть повторяющуюся роль в ядерной деградации мРНК.

Рисунок 1.

Инактивация экзосом приводит к накоплению полиА РНК в определенных ядерных фокусах.( A ) Данные вестерн- и RT-PCR, показывающие эффективность нокдауна компонентов экзосомы и MTR4. Различное количество клеток или продуктов ОТ контрольных клеток с нокдауном использовали для оценки эффективности нокдауна. ( B ) FISH-анализ распределения полиА РНК в экзосомах и клетках с нокдауном MTR4. Для всех изображений была сделана одинаковая экспозиция. Окрашивание DAPI служило маркером ядра. ( C ) Количественная оценка ядерных сигналов полиА РНК FISH. Ядерная полиА-РНК FISH-сигналы, полученные от 30 клеток в каждом эксперименте, были определены Image J.Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения от биологических повторов ( n = 3). Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t . * P <0,05, ** P <0,01. ( D ) Мутант MTR4 дикого типа, но не мутант по ядру геликазы репрессировал фенотип накопления ядерной полиА РНК в клетках с нокдауном MTR4. Схематическое изображение домена MTR4 показано вверху. Указаны функциональные домены и отмечены точечные мутации D252A и E253A.MTR4 siRNA трансфицировали в клетки HeLa с использованием Lipofectamine 2000. Через сорок восемь часов после трансфекции чувствительную или резистентную к siRNA WT Flag-MTR4 или плазмиду экспрессии MTR4 мутантного ядра геликазы, резистентного к siRNA, трансфицировали в клетки, обработанные siRNA MTR4. Через 24 часа после трансфекции проводили FISH-анализ для наблюдения за распределением полиА РНК. ПФ с антителом Flag выполняли для исследования экзогенной экспрессии MTR4. Окрашивание DAPI служило маркером ядра. Стрелки указывают клетки, для которых фенотип накопления ядерной полиА-РНК репрессирован экзогенно экспрессируемым MTR4.( E ) Накопленные в ядрах поли-А-РНК не локализуются совместно с NS, параспеклами, тельцами Кахаля или тельцами PML в клетках с нокдауном RRP40. FISH выполняли с использованием зонда олиго-dT 70 (н.о.) и проводили IF с использованием указанных антител. Окрашивание DAPI служило маркером ядра. Конфокальная микроскопия использовалась для визуализации клеток.

Рисунок 1.

Инактивация экзосом приводит к накоплению полиА РНК в определенных ядерных фокусах. ( A ) Данные вестерн- и RT-PCR, показывающие эффективность нокдауна компонентов экзосомы и MTR4.Различное количество клеток или продуктов ОТ контрольных клеток с нокдауном использовали для оценки эффективности нокдауна. ( B ) FISH-анализ распределения полиА РНК в экзосомах и клетках с нокдауном MTR4. Для всех изображений была сделана одинаковая экспозиция. Окрашивание DAPI служило маркером ядра. ( C ) Количественная оценка ядерных сигналов полиА РНК FISH. Ядерная полиА РНК FISH-сигналы, измеренные количественно от 30 клеток в каждом эксперименте с помощью Image J. Столбики ошибок представляют стандартные отклонения от биологических повторов ( n = 3).Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t . * P <0,05, ** P <0,01. ( D ) Мутант MTR4 дикого типа, но не мутант по ядру геликазы репрессировал фенотип накопления ядерной полиА РНК в клетках с нокдауном MTR4. Схематическое изображение домена MTR4 показано вверху. Указаны функциональные домены и отмечены точечные мутации D252A и E253A. MTR4 siRNA трансфицировали в клетки HeLa с использованием Lipofectamine 2000. Через сорок восемь часов после трансфекции чувствительную или резистентную к siRNA WT Flag-MTR4 или плазмиду экспрессии MTR4 мутантного ядра геликазы, резистентного к siRNA, трансфицировали в клетки, обработанные siRNA MTR4.Через 24 часа после трансфекции проводили FISH-анализ для наблюдения за распределением полиА РНК. ПФ с антителом Flag выполняли для исследования экзогенной экспрессии MTR4. Окрашивание DAPI служило маркером ядра. Стрелки указывают клетки, для которых фенотип накопления ядерной полиА-РНК репрессирован экзогенно экспрессируемым MTR4. ( E ) Накопленные в ядрах поли-А-РНК не локализуются совместно с NS, параспеклами, тельцами Кахаля или тельцами PML в клетках с нокдауном RRP40. FISH выполняли с использованием зонда олиго-dT 70 (н.о.) и проводили IF с использованием указанных антител.Окрашивание DAPI служило маркером ядра. Конфокальная микроскопия использовалась для визуализации клеток.

Принимая во внимание, что нокдаун различных компонентов экзосом приводит к одинаковому увеличению ядерных сигналов полиА РНК, эти фенотипы, по-видимому, вряд ли будут вызваны эффектом siRNA вне мишени. Чтобы изучить возможный нецелевой эффект миРНК MTR4, мы провели спасательный эксперимент. Экспрессия siRNA-устойчивого MTR4 дикого типа, но не siRNA-чувствительного дикого типа или устойчивого к siRNA-геликазы DExH корового мутанта MTR4 репрессировала усиленные сигналы polyA РНК (рис. 1D).Этот результат указывает на то, что усиление сигналов полиА РНК является прямым эффектом нокдауна MTR4 и что активность геликазы может быть необходима для функционирования MTR4 при опосредованной экзосомами деградации мРНК.

Ядерные полиА РНК в основном локализуются в NS в нормальных клетках млекопитающих (14,17-19). Однако анализ совместной локализации показал, что в клетках с нокдауном экзосом большинство ядерных фокусов полиА РНК не перекрываются с SC35, стандартным маркером для NS (рис. 1E). Мы также исследовали, накапливались ли эти очаги полиА в тельцах Кахаля, параспеклах или тельцах PML, но видимой совместной локализации не наблюдалось (рис. 1E).Эти данные указывают на то, что мРНК мишени экзосом может не деградировать в основном в этих основных субядерных доменах.

Инактивация экзосом, по-видимому, не влияет на экспорт мРНК

Возможно, инактивация экзосом ингибировала экспорт мРНК, что приводило к накоплению ядерной полиА РНК. Однако такая возможность не подтверждается следующими данными. Во-первых, нокдаун фактора экспорта мРНК UAP56 блокировал ядерный экспорт мРНК HSPA1A, которая не является мишенью экзосомы, тогда как истощение ни RRP40, ни MTR4 не имело очевидного эффекта (Рисунок 2A и B; дополнительный рисунок S2).Во-вторых, как и ожидалось для ингибирования экспорта мРНК, нокдаун UAP56 приводит к усилению ядерных и снижению сигналов цитоплазматической полиА РНК. Напротив, в ядерных экзосомах и клетках с нокдауном MTR4 ядерные FISH-сигналы значительно увеличиваются без видимых изменений в цитоплазматических (рис. 2C и D). Обратите внимание, что здесь ядерно-специфические компоненты экзосом RRP6 и DIS3 были истощены, чтобы специфически ингибировать функции ядерных экзосом. Хотя остается возможным, что ядерный экспорт некоторых конкретных мРНК был нарушен, эти данные вместе показывают, что усиление ядерных сигналов полиА при инактивации экзосом не является результатом ингибирования экспорта мРНК.

Рисунок 2.

Ядерный экспорт

мРНК, по-видимому, не зависит от инактивации экзосом. ( A ) Вестерн-блоттинг для изучения эффективности подавления UAP56. GAPDH используется как средство контроля загрузки. ( B ) Ядерный экспорт мРНК репортера HSPA1A не затрагивается в экзосомах и клетках с нокдауном MTR4. Конструкцию репортерной мРНК HSPA1A инъецировали в ядра контрольных клеток, клеток с нокдауном UAP56, RRP40 и MTR4, а затем проводили FISH для определения распределения мРНК HSPA1A через 4 часа после инъекции.На изображениях-вставках показан маркер инъекции. Для всех изображений была сделана одинаковая экспозиция. Количественная оценка ядерных и цитоплазматических сигналов FISH мРНК HSPA1A. Отношения N / C определяли для 30 клеток в каждом эксперименте. C и N обозначают цитоплазматический и ядерный FISH-сигналы соответственно. Планки погрешностей, стандартные отклонения ( n = 3). Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t . *** P <0,001. ( C ) Распределение PolyA РНК в клетках с нокдауном UAP56, RRP6 / DIS3 и MTR4.Указанные миРНК трансфицировали в клетки HeLa. Через 72 часа после трансфекции проводили FISH для наблюдения за распределением полиА РНК. Окрашивание DAPI служило маркером ядра. Обратите внимание, что для точной количественной оценки сигналов polyA во всех образцах были сделаны одинаковые экспозиции для всех изображений FISH. ( D ) Количественная оценка ядерных и цитоплазматических сигналов полиА РНК FISH. Ядерные и цитоплазматические сигналы полиА РНК FISH, количественно измеренные от 50 клеток в каждом эксперименте с помощью Image J. Столбики ошибок представляют стандартные отклонения от биологических повторов ( n = 3).Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t . * P <0,05, ** P <0,01.

Рисунок 2.

Ядерный экспорт

мРНК, по-видимому, не зависит от инактивации экзосом. ( A ) Вестерн-блоттинг для изучения эффективности подавления UAP56. GAPDH используется как средство контроля загрузки. ( B ) Ядерный экспорт мРНК репортера HSPA1A не затрагивается в экзосомах и клетках с нокдауном MTR4. Конструкцию репортерной мРНК HSPA1A инъецировали в ядра контрольных клеток, клеток с нокдауном UAP56, RRP40 и MTR4, а затем проводили FISH для определения распределения мРНК HSPA1A через 4 часа после инъекции.На изображениях-вставках показан маркер инъекции. Для всех изображений была сделана одинаковая экспозиция. Количественная оценка ядерных и цитоплазматических сигналов FISH мРНК HSPA1A. Отношения N / C определяли для 30 клеток в каждом эксперименте. C и N обозначают цитоплазматический и ядерный FISH-сигналы соответственно. Планки погрешностей, стандартные отклонения ( n = 3). Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t . *** P <0,001. ( C ) Распределение PolyA РНК в клетках с нокдауном UAP56, RRP6 / DIS3 и MTR4.Указанные миРНК трансфицировали в клетки HeLa. Через 72 часа после трансфекции проводили FISH для наблюдения за распределением полиА РНК. Окрашивание DAPI служило маркером ядра. Обратите внимание, что для точной количественной оценки сигналов polyA во всех образцах были сделаны одинаковые экспозиции для всех изображений FISH. ( D ) Количественная оценка ядерных и цитоплазматических сигналов полиА РНК FISH. Ядерные и цитоплазматические сигналы полиА РНК FISH, количественно измеренные от 50 клеток в каждом эксперименте с помощью Image J. Столбики ошибок представляют стандартные отклонения от биологических повторов ( n = 3).Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t . * P <0,05, ** P <0,01.

Повышение ядерных сигналов полиА при инактивации экзосом происходит не главным образом из-за удлиненного хвоста полиА

В предыдущей работе сообщалось, что инактивация экзосом приводит к накоплению гипераденилированных РНК PABPN1-зависимым образом (25). Таким образом, возможно, что усиление сигналов полиА РНК при истощении экзосомы или MTR4 может отражать удлиненный хвост полиА, а не повышенные уровни транскриптов.Чтобы проверить эту возможность, мы сначала исследовали длину полиА-хвоста ядерных РНК в контрольных и нокдаун MTR4 клетках (рис. 3A и B). Клетки с нокдауном PABPN1 использовали в качестве контроля, показывающего измененную длину хвоста полиА. В соответствии с предыдущим сообщением (25), полиА-хвост ядерных РНК был длиннее в клетках с нокдауном MTR4, а совместный нокдаун PABPN1 отменял это удлинение (Рисунок 3C). Если бы усиление сигналов полиА РНК при инактивации экзосом в основном было результатом удлинения полиА-хвоста, можно было бы ожидать, что устранение этого удлинения уменьшит усиление сигналов.Однако по сравнению с таковыми в клетках с нокдауном MTR4, сигналы polyA FISH, по-видимому, не уменьшались в клетках с одновременным нокдауном MTR4 / PABPN1 (Фигуры 3D и E). Вместе эти данные предполагают, что усиление сигналов полиА РНК при инактивации экзосом в основном не является результатом удлиненного хвоста полиА, но, вероятно, отражает повышенные уровни транскриптов.

Рисунок 3.

Увеличение ядерных сигналов полиА при инактивации экзосом происходит не в основном из-за удлинения хвоста полиА.( A ) Вестерн-блоттинг для изучения эффективности подавления MTR4 и PABPN1. Клетки HeLa трансфицировали миРНК, нацеленными на указанные гены. Через 72 часа после трансфекции проводили вестерн-блоттинг с указанными антителами. GAPDH используется как средство контроля загрузки. ( B ) Вестерн-блоттинг для исследования чистоты ядерных и цитоплазматических фракций, полученных из контрольных, MTR4, PABPN1 и MTR4 / PABPN1 клеток с нокдауном. UAP56 и тубулин используются в качестве ядерных и цитоплазматических маркеров соответственно.( C ) Анализ ядерного хвоста полиА РНК из клеток, трансфицированных указанными миРНК. ( D ) Распределение полиА РНК в клетках с нокдауном MTR4, MTR4 / PABPN1. Клетки HeLa, трансфицированные указанными миРНК, использовали для анализа FISH для изучения распределения полиА РНК. Окрашивание DAPI использовали для обозначения ядер. Обратите внимание, что для точной количественной оценки сигналов polyA во всех образцах были сделаны одинаковые экспозиции для всех изображений FISH. ( E ) Количественная оценка общих сигналов FISH полиА РНК.Суммарные сигналы полиА РНК FISH, определенные количественно от 30 клеток в каждом эксперименте с помощью изображения J. Полоса ошибок представляет стандартные отклонения от трех биологических повторов. Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t . *** P <0,001. ( F ) Сигнал ядерной РНК-seq показывает, что сплайсированная мРНК RHOC накапливается в клетках с нокдауном RRP40. ( G ) (Слева) FISH-сигналы эндогенной мРНК RHOC в контрольных клетках и клетках с нокдауном RRP40. (Справа) Количественная оценка сигналов ядерной мРНК RHOC FISH.Ядерная мРНК RHOC FISH-сигналы количественно определяли из 30 клеток в трех экспериментах с помощью Image J. Полоса ошибок представляет стандартные отклонения от биологических повторов ( n = 3). Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t . *** P <0,001.

Рисунок 3.

Увеличение ядерных сигналов полиА при инактивации экзосом происходит не в основном из-за удлиненного хвоста полиА. ( A ) Вестерн-блоттинг для изучения эффективности подавления MTR4 и PABPN1.Клетки HeLa трансфицировали миРНК, нацеленными на указанные гены. Через 72 часа после трансфекции проводили вестерн-блоттинг с указанными антителами. GAPDH используется как средство контроля загрузки. ( B ) Вестерн-блоттинг для исследования чистоты ядерных и цитоплазматических фракций, полученных из контрольных, MTR4, PABPN1 и MTR4 / PABPN1 клеток с нокдауном. UAP56 и тубулин используются в качестве ядерных и цитоплазматических маркеров соответственно. ( C ) Анализ ядерного хвоста полиА РНК из клеток, трансфицированных указанными миРНК.( D ) Распределение полиА РНК в клетках с нокдауном MTR4, MTR4 / PABPN1. Клетки HeLa, трансфицированные указанными миРНК, использовали для анализа FISH для изучения распределения полиА РНК. Окрашивание DAPI использовали для обозначения ядер. Обратите внимание, что для точной количественной оценки сигналов polyA во всех образцах были сделаны одинаковые экспозиции для всех изображений FISH. ( E ) Количественная оценка общих сигналов FISH полиА РНК. Суммарные сигналы полиА РНК FISH, измеренные в 30 клетках в каждом эксперименте с помощью Image J.Планка погрешностей представляет собой стандартные отклонения от трех биологических повторов. Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t . *** P <0,001. ( F ) Сигнал ядерной РНК-seq показывает, что сплайсированная мРНК RHOC накапливается в клетках с нокдауном RRP40. ( G ) (Слева) FISH-сигналы эндогенной мРНК RHOC в контрольных клетках и клетках с нокдауном RRP40. (Справа) Количественная оценка сигналов ядерной мРНК RHOC FISH. Сигналы FISH мРНК ядерной RHOC были количественно определены в 30 клетках в трех экспериментах Image J.Планка ошибок представляет собой стандартные отклонения от биологических повторов ( n = 3). Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t . *** P <0,001.

Чтобы определить, действительно ли повышенные уровни транскриптов могут приводить к усилению сигналов FISH, мы сравнили специфичный для транскрипта сигнал FISH мРНК-мишени экзосомы, RHOC, в контрольных клетках и клетках с нокдауном RRP40 (рис. 3F и G). В соответствии с результатом RNA-seq, ядерные сигналы RHOC FISH действительно становились явно более сильными в клетках, истощенных по RRP40.Вместе эти данные предполагают, что усиление сигналов полиА FISH при инактивации экзосом в основном является результатом повышения уровней РНК.

МРНК-мишени экзосом накапливаются в фокусах полиА РНК

Далее мы попытались изучить, какие виды РНК накапливаются в фокусах полиА при инактивации экзосом. С этой целью мы проанализировали наши предыдущие ядерные данные polyA RNA-seq для контрольных клеток и клеток с нокдауном MTR4 (9). Среди РНК, которые стабилизируются более чем в 1,5 раза после нокдауна MTR4, 60 и 35% составляли мРНК и днРНК / PROMPT, соответственно (рис. 4A).Чтобы определить, какой тип РНК вносит наибольший вклад в накопление РНК polyA, мы вычислили считывания секвенирования, сопоставленные с этими накопленными РНК. Примечательно, что 84% из них были из мРНК (рис. 4B). Этот анализ показывает, что большинство накопленных поли-А-РНК являются мРНК, и предполагает, что нуклеоплазматические фокусы поли-А могут быть в основном образованы стабилизированными мРНК-мишенями ядерных экзосом. В соответствии с предыдущим открытием, что инактивация экзосом приводит к стабилизации различных частей отдельных мРНК (9), очевидное накопление было обнаружено в 5′-, среднем и 3′-фрагментах мРНК в масштабе всего генома (рис. 4C).Таким образом, хотя возможно, что определенная часть некоторых транскриптов более чувствительна к инактивации экзосом, то есть птРНК (8), полноразмерные транскрипты значительных фракций мРНК, вероятно, стабилизируются.

Рисунок 4.

Ядерные фокусы полиА могут быть в основном образованы мРНК-мишенями экзосом. ( A ) Круговая диаграмма представляет количественное распределение РНК, частота вращения которых увеличилась более чем в 1,5 раза при нокдауне MTR4 по сравнению с контрольным нокдауном.Каждая категория представляет РНК, уникальные для этой категории и не перекрывающиеся с предыдущими категориями, при этом начальная категория обозначена как «короткая нкРНК» и продолжается по часовой стрелке. ( B ) То же, что (A), за исключением того, что были показаны распределения чтения накопленных РНК. ( C ) Коробчатые диаграммы представляют распределение накопленных в ядре считываний по различным частям мРНК в клетках с нокдауном MTR4 в масштабе всего генома. Каждая мРНК разделена на 5 ‘, среднюю и 3’ части равной длины.( D ) Локализация мРНК RHOC в контрольных клетках и клетках с нокдауном RRP40. Окрашивание SC35 и DAPI служило маркером для NS и ядра соответственно. Конфокальная микроскопия использовалась для визуализации клеток. Стрелки указывают на мРНК RHOC, локализованную совместно с полиА РНК. Примеры очагов полиА РНК, которые явно не локализуются вместе с мРНК RHOC, указаны стрелками. ( E ) Количественная оценка точечного сигнала FISH мРНК RHOC, которая локализована в ядерных фокусах, образованных полиА РНК.Столбики на графике показывают процентную долю полиА-положительного RHOC-точечного сигнала FISH. ( F и G ) То же, что (D и E), за исключением того, что мРНК DDX39B была обнаружена в контроле и клетках с нокдауном MTR4.

Рисунок 4.

Ядерные фокусы полиА могут быть в основном образованы мРНК-мишенями экзосом. ( A ) Круговая диаграмма представляет количественное распределение РНК, частота вращения которых увеличилась более чем в 1,5 раза при нокдауне MTR4 по сравнению с контрольным нокдауном.Каждая категория представляет РНК, уникальные для этой категории и не перекрывающиеся с предыдущими категориями, при этом начальная категория обозначена как «короткая нкРНК» и продолжается по часовой стрелке. ( B ) То же, что (A), за исключением того, что были показаны распределения чтения накопленных РНК. ( C ) Коробчатые диаграммы представляют распределение накопленных в ядре считываний по различным частям мРНК в клетках с нокдауном MTR4 в масштабе всего генома. Каждая мРНК разделена на 5 ‘, среднюю и 3’ части равной длины.( D ) Локализация мРНК RHOC в контрольных клетках и клетках с нокдауном RRP40. Окрашивание SC35 и DAPI служило маркером для NS и ядра соответственно. Конфокальная микроскопия использовалась для визуализации клеток. Стрелки указывают на мРНК RHOC, локализованную совместно с полиА РНК. Примеры очагов полиА РНК, которые явно не локализуются вместе с мРНК RHOC, указаны стрелками. ( E ) Количественная оценка точечного сигнала FISH мРНК RHOC, которая локализована в ядерных фокусах, образованных полиА РНК.Столбики на графике показывают процентную долю полиА-положительного RHOC-точечного сигнала FISH. ( F и G ) То же, что (D и E), за исключением того, что мРНК DDX39B была обнаружена в контроле и клетках с нокдауном MTR4.

Действительно ли мРНК-мишени ядерных экзосом накапливаются в фокусах полиА? Чтобы ответить на этот вопрос, мы провели анализ совместной локализации мРНК-мишени экзосомы с полиА РНК. В контрольных клетках мРНК RHOC совмещена с полиА РНК и SC35. Напротив, в клетках с нокдауном RRP40 он, по-видимому, не обнаруживается в NS, но, по крайней мере, частично совмещен с полиА РНК (рис. 4D, стрелки и 4E).Фокусы полиА-РНК, которые не содержат эту мРНК, могут быть образованы другими мишенями экзосом (рис. 4D, стрелки). Чтобы изучить локализацию мРНК-мишени экзосом в истощенных по MTR4 клетках, мРНК DDX39B, которая чувствительна к истощению MTR4, была использована для анализа совместной локализации (дополнительный рисунок S3). В самом деле, он был локализован в некоторых фокусах полиА, накопленных в клетках с нокдауном MTR4 (фиг.4F и G). Эти результаты предполагают, что специфические фокусы полиА РНК, наблюдаемые при инактивации экзосом, могут быть в первую очередь образованы мРНК-мишенями экзосом.

Фокусы PolyA в клетках, инактивированных экзосомами, в основном возникают не из-за накопления субстратов TRAMP, NEXT или ZFC3h2

В клетках млекопитающих MTR4 образует отдельные комплексы, которые связывают экзосому с различными видами субстратных РНК (5,7,8). Хотя наши данные RNA-seq показывают, что мРНК является наиболее распространенной, накапливающей полиА РНК при инактивации экзосом, возможность того, что другие виды мишеней экзосом также вносят важный вклад, все еще остается. PROMPT полиаденилированы и более значительно стабилизируются, чем мРНК, при инактивации экзосом (5,9).Чтобы проверить, приводят ли стабилизированные PROMPT к накоплению очагов полиА, мы истощили компоненты NEXT RBM7 и ZCCHC8 по отдельности или в комбинации (рис. 5А). В этих нокдаун клетках, хотя накопление всех полиаденилированных PROMPT, которые мы тестировали, было сравнимо с таковым при нокдауне RRP40, не наблюдалось накопления полиА РНК (Рис. 5B – D). Вероятно, это связано с низким содержанием PROMPT даже после стабилизации. В подтверждение этой возможности в клетках, инактивированных экзосомами, популяция считывания PROMPT составляет лишь одну десятую от популяции мРНК (рис. 5E).Эти данные предполагают, что накопленные PROMPT не объясняют главную причину увеличения сигналов полиА, которые мы наблюдали в клетках, инактивированных экзосомами.

Рисунок 5.

Формирование фокусов полиА при инактивации экзосом происходит не в основном из-за накопления субстратов TRAMP, NEXT или ZFC3h2. ( A ) Вестерн-блоттинг показывает, что компоненты NEXT эффективно разрушаются. Тубулин используется в качестве контроля нагрузки. ( B ) PROMPT накапливаются аналогичным образом в клетках с нокдауном RRP40 и NEXT.Клетки HeLa трансфицировали контрольными миРНК RRP40, RBM7, ZCCHC8 и RBM7 / ZCCHC8 через 72 часа после трансфекции, получали полиА-РНК с последующим RT-qPCR с наборами праймеров, которые специфически амплифицируют указанные PROMPT. R7 и Z8 представляют собой RBM7 и ZCCHC8 соответственно. Столбики показывают уровни РНК относительно GAPDH. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения от биологических повторов ( n = 3). Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t . * P <0.05, ** P <0,01, *** P <0,001. ( C ) Распределение полиА-РНК в клетках с нокдауном NEXT не влияет. Клетки HeLa, трансфицированные указанными миРНК, использовали для анализа FISH для наблюдения за распределением полиА РНК. Окрашивание DAPI служило маркером ядра. ( D ) Количественная оценка ядерных сигналов полиА РНК FISH от 30 клеток в каждом эксперименте с помощью изображения J. Полоса ошибок представляет стандартные отклонения от трех биологических повторов. *** P <0.001. ( E ) Относительное количество считываний PROMPT и мРНК в клетке с нокдауном MTR4. ( F ) Результаты вестерн-блоттинга показывают, что компоненты TRAMP были эффективно разрушены. Тубулин используется в качестве контроля нагрузки. ( G ) То же, что (C), за исключением того, что для этого эксперимента использовали клетки для нокдауна TRAMP. ( H ) Количественная оценка ядерных сигналов полиА РНК FISH от 30 клеток в каждом эксперименте с помощью Image J. Полоса ошибок представляет стандартные отклонения от трех биологических повторов.Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t . *** P <0,001. ( I ) RT-qPCR для проверки эффективности подавления ZFC3h2. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения от биологических повторов ( n = 3). Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t . *** P <0,001. ( J ) ОТ-кПЦР для исследования уровней транскрипта SNHG в контрольных, нокдаун-клетках MTR4 и ZFC3h2. Столбики показывают уровни РНК относительно 18S рРНК.Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения от биологических повторов ( n = 3). Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t . ** P <0,01, *** P <0,001. ( K ) FISH-анализ распределения полиА РНК в клетках с нокдауном ZFC3h2. (Левая панель) Клетки HeLa, трансфицированные миРНК ZFC3h2, использовали для анализа FISH для наблюдения за распределением полиА РНК. Окрашивание DAPI служило маркером ядра. (Правая панель) Количественная оценка ядерных сигналов полиА РНК FISH от 30 клеток в каждом эксперименте с помощью Image J.Планка погрешностей представляет собой стандартные отклонения от трех биологических повторов. *** P <0,001. ( L ) Накопленные в ядрах полиА РНК в клетках с нокдауном ZFC3h2 совместно локализуются с NS, FISH проводили с использованием 70 (н.о.) олиго-dT зонда и проводили IF с использованием антитела SC35. Конфокальная микроскопия использовалась для визуализации клеток.

Рисунок 5.

Формирование фокусов полиА при инактивации экзосом происходит не в основном из-за накопления субстратов TRAMP, NEXT или ZFC3h2.( A ) Вестерн-блоттинг показывает, что компоненты NEXT эффективно разрушаются. Тубулин используется в качестве контроля нагрузки. ( B ) PROMPT накапливаются аналогичным образом в клетках с нокдауном RRP40 и NEXT. Клетки HeLa трансфицировали контрольными миРНК RRP40, RBM7, ZCCHC8 и RBM7 / ZCCHC8 через 72 часа после трансфекции, получали полиА-РНК с последующим RT-qPCR с наборами праймеров, которые специфически амплифицируют указанные PROMPT. R7 и Z8 представляют собой RBM7 и ZCCHC8 соответственно. Столбики показывают уровни РНК относительно GAPDH.Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения от биологических повторов ( n = 3). Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t . * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001. ( C ) Распределение полиА-РНК в клетках с нокдауном NEXT не влияет. Клетки HeLa, трансфицированные указанными миРНК, использовали для анализа FISH для наблюдения за распределением полиА РНК. Окрашивание DAPI служило маркером ядра. ( D ) Количественная оценка ядерных сигналов полиА РНК FISH от 30 клеток в каждом эксперименте по Image J.Планка погрешностей представляет собой стандартные отклонения от трех биологических повторов. *** P <0,001. ( E ) Относительное количество считываний PROMPT и мРНК в клетке с нокдауном MTR4. ( F ) Результаты вестерн-блоттинга показывают, что компоненты TRAMP были эффективно разрушены. Тубулин используется в качестве контроля нагрузки. ( G ) То же, что (C), за исключением того, что для этого эксперимента использовали клетки для нокдауна TRAMP. ( H ) Количественная оценка ядерных сигналов полиА РНК FISH от 30 клеток в каждом эксперименте по Image J.Планка погрешностей представляет собой стандартные отклонения от трех биологических повторов. Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t . *** P <0,001. ( I ) RT-qPCR для проверки эффективности подавления ZFC3h2. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения от биологических повторов ( n = 3). Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t . *** P <0,001. ( J ) ОТ-кПЦР для исследования уровней транскрипта SNHG в контрольных, нокдаун-клетках MTR4 и ZFC3h2.Столбики показывают уровни РНК относительно 18S рРНК. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения от биологических повторов ( n = 3). Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t . ** P <0,01, *** P <0,001. ( K ) FISH-анализ распределения полиА РНК в клетках с нокдауном ZFC3h2. (Левая панель) Клетки HeLa, трансфицированные миРНК ZFC3h2, использовали для анализа FISH для наблюдения за распределением полиА РНК. Окрашивание DAPI служило маркером ядра.(Правая панель) Количественная оценка ядерных сигналов полиА РНК FISH от 30 клеток в каждом эксперименте с помощью изображения J. Полоса ошибок представляет стандартные отклонения от трех биологических повторов. *** P <0,001. ( L ) Накопленные в ядрах полиА РНК в клетках с нокдауном ZFC3h2 совместно локализуются с NS, FISH проводили с использованием 70 (н.о.) олиго-dT зонда и проводили IF с использованием антитела SC35. Конфокальная микроскопия использовалась для визуализации клеток.

Также возможно, что PAPD5, который, как полагают, представляет собой поли-А-полимеразу в человеческом TRAMP-комплексе, добавляет короткий поли-А-хвост к экзосомным мишеням, которые обычно не полиаденилированы, что приводит к усилению сигналов поли-А при инактивации экзосом.Однако нокдаун PAPD5 не влиял на накопление ядерной polyA РНК в MTR4-истощенных клетках (Figure 5F-H). Соответственно, одиночный или двойной нокдаун PAPD5 и другого компонента TRAMP, ZCCHC7, не приводил к накоплению ядерной polyA РНК (Figure 5F-H). Эти результаты предполагают, что субстраты TRAMP не вносят важный вклад в усиление сигналов полиА.

Недавние исследования показали, что MTR4 вместе с ZFC3h2 участвует в деградации длинных транскриптов и нестабильных коротких РНК (7,8).Чтобы проверить, могли ли эти РНК вызывать накопление полиА-фокусов при инактивации экзосом, мы истощили ZFC3h2. Как и ожидалось, истощение ZFC3h2 привело к очевидному накоплению РНК SNHG (рис. 5I и J) (7). Хотя ядерные полиА-РНК FISH-сигналы были повышены в этих нокдаун-клетках, в отличие от тех, которые обнаруживаются в клетках с истощенными экзосомами, эти РНК, по-видимому, были совместно локализованы с SC35 (фиг. 5K и L). Причина этого повышенного уровня ядерных сигналов полиА РНК остается неясной. Одна возможность состоит в том, что стабилизированные транскрипты SNHG и нестабильные РНК конкурируют с мРНК за механизм ядерного экспорта, что приводит к частичному удержанию ядерной мРНК.Альтернативно, повышенная флуоресценция может быть результатом мишеней ZFC3h2, которые накапливаются в NS. Тем не менее, этот результат не подтверждает возможность того, что фокусы полиА, обнаруженные при инактивации экзосом, в основном образованы мишенями ZFC3h2. Вместе с данными polyA RNA-seq, мРНК-мишени экзосом, вероятно, вносят наиболее важный вклад в ядерные фокусы полиА, накапливаемые при инактивации экзосом, хотя по-прежнему возможно, что некоторые РНК-мишени NEXT, TRAMP и ZFC3h2 также накапливаются в этих фокусах.

МРНК-мишени экзосомы в основном не деградируют в NS

Накапливающиеся данные указывают на то, что большинство мРНК проходит через NS перед ядерным экспортом (14-19). Наблюдение за тем, что мРНК мишени экзосом не накапливаются в NSs, повысило вероятность того, что эти мРНК могут не деградировать в основном в этих доменах. Однако также возможно, что экзосомальная деградация действительно происходит внутри NS, и когда экзосома инактивирована, накопленные мишени высвобождаются из NS в нуклеоплазму.В этом случае можно было бы ожидать, что нацеливание мРНК-мишени экзосомы на NS снижает ее стабильность. Чтобы проверить это, мы использовали элемент РНК (элемент нацеливания на спекл, STE), который нацелен на мРНК репортера cG (транскрипт кДНК β-глобина), мишень экзосомы, которая в противном случае не связывается с NS (14), в эти субъядерные домены. Примечательно, что нацеливание на спеклы не уменьшало, а, по-видимому, увеличивало уровень мРНК cG (рис. 6А, левая панель), что позволяет предположить, что нацеливание на спеклы стабилизирует мРНК-мишени экзосом.Чтобы проверить, связана ли эта стабилизация с предотвращением экзосомальной деградации, мы сравнили чувствительность мРНК cG и cG-STE к нокдауну MTR4. Важно отметить, что мРНК cG-STE (увеличение в 1,4 раза) была явно менее чувствительной, чем мРНК cG (увеличение в 2,7 раза), что указывает на то, что нацеливание на спекл повышает стабильность мРНК, предотвращая деградацию экзосом (Рисунок 6A, правая панель). Оставшаяся чувствительность мРНК cG-STE может быть связана с ее неполным нацеливанием на спеклы. Вместе наши данные подтверждают мнение, что мРНК мишени экзосом в основном деградируют в нуклеоплазме, но не в NSs.

Рисунок 6.

МРНК-мишени экзосом в основном деградируют перед прохождением через NS. ( A ) Нацеливание на спеклы мРНК cG предотвращает деградацию экзосом. RT-qPCR для исследования уровней мРНК cG или мРНК cG-STE в нормальных клетках HeLa (левая панель) или в контрольных клетках и клетках с нокдауном MTR4 (правая панель). ( B ) Нокдаун PABPN1 и UAP56 ингибируют высвобождение мРНК из NS. Конфокальная микроскопия использовалась для изучения распределения полиА РНК в контрольных, нокдаун-клетках PABPN1 и UAP56.SC35 использовался для маркировки NS. ( C ) RT-qPCR для исследования уровней указанных мРНК из клеток HeLa, обработанных контрольными миРНК, MTR4, PABPN1 или UAP56 / URh59. Относительные уровни указанных РНК по отношению к 18S рРНК были количественно определены и указаны на графике. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения от биологических повторов ( n = 3). Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t . * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0.001. ( D ) Две возможности в сайтах накопления мРНК-мишени экзосом, когда высвобождение мРНК из NS ингибируется. (I) они будут накапливаться как внутри, так и вне NS, если деградация происходит до попадания в NS; (II) они будут накапливаться исключительно внутри NS, если деградация происходит после высвобождения из NS. ( E ) (Вверху) Конфокальную микроскопию использовали для исследования совместной локализации полиА РНК с NS в контроле, MTR4, MTR4 / PABPN1 и MTR4 / UAP56 нокдаун клеток.(Внизу) Количественная оценка фокусов полиА, которые не локализуются совместно с SC35 в каждой ячейке. Для анализа каждого образца использовали тридцать ячеек. ( F ) Истощение MTR4 приводит к цитоплазматическому накоплению транскриптов cG и cS. (Вверху) Репортерную конструкцию cG или cS инъецировали в ядра контрольных клеток и клеток с нокдауном MTR4 с последующим FISH с использованием векторного зонда для определения распределения соответствующей мРНК через 2 часа после инъекции. Для всех изображений была сделана одинаковая экспозиция.На изображениях-вставках показан маркер инъекции. Окрашивание DAPI служило маркером ядра. (Внизу) Количественная оценка ядерных и цитоплазматических сигналов FISH соответствующей мРНК. Отношения N / C определяли для 30 клеток в каждом эксперименте. N и C обозначают ядерные и цитоплазматические сигналы FISH соответственно. Планки погрешностей, стандартные отклонения ( n = 3). *** P <0,001. ( G ) (Вверху) Репортерную конструкцию cS вводили в ядра клеток с нокдауном MTR4 и MTR / UAP56 с последующим FISH для определения распределения соответствующей мРНК через 2 часа после инъекции.Для всех изображений была сделана одинаковая экспозиция. На изображениях-вставках показан маркер инъекции. Окрашивание DAPI служило маркером ядра. (Внизу) Количественная оценка ядерных и цитоплазматических сигналов FISH cS мРНК. Отношения N / C определяли для 30 клеток в каждом эксперименте. N и C обозначают ядерные и цитоплазматические сигналы FISH соответственно. Планки погрешностей, стандартные отклонения ( n = 3). *** P <0,001. ( H ) Накопленная в ядре мРНК cS в клетках с нокдауном MTR4 / UAP56 частично совмещается с NS.Были выполнены FISH с векторным зондом и IF с использованием антитела SC35.

Рисунок 6.

МРНК-мишени экзосом в основном деградируют перед прохождением через NS. ( A ) Нацеливание на спеклы мРНК cG предотвращает деградацию экзосом. RT-qPCR для исследования уровней мРНК cG или мРНК cG-STE в нормальных клетках HeLa (левая панель) или в контрольных клетках и клетках с нокдауном MTR4 (правая панель). ( B ) Нокдаун PABPN1 и UAP56 ингибируют высвобождение мРНК из NS. Конфокальная микроскопия использовалась для изучения распределения полиА РНК в контрольных, нокдаун-клетках PABPN1 и UAP56.SC35 использовался для маркировки NS. ( C ) RT-qPCR для исследования уровней указанных мРНК из клеток HeLa, обработанных контрольными миРНК, MTR4, PABPN1 или UAP56 / URh59. Относительные уровни указанных РНК по отношению к 18S рРНК были количественно определены и указаны на графике. Планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения от биологических повторов ( n = 3). Статистический анализ проводился с использованием критерия Стьюдента t . * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0.001. ( D ) Две возможности в сайтах накопления мРНК-мишени экзосом, когда высвобождение мРНК из NS ингибируется. (I) они будут накапливаться как внутри, так и вне NS, если деградация происходит до попадания в NS; (II) они будут накапливаться исключительно внутри NS, если деградация происходит после высвобождения из NS. ( E ) (Вверху) Конфокальную микроскопию использовали для исследования совместной локализации полиА РНК с NS в контроле, MTR4, MTR4 / PABPN1 и MTR4 / UAP56 нокдаун клеток.(Внизу) Количественная оценка фокусов полиА, которые не локализуются совместно с SC35 в каждой ячейке. Для анализа каждого образца использовали тридцать ячеек. ( F ) Истощение MTR4 приводит к цитоплазматическому накоплению транскриптов cG и cS. (Вверху) Репортерную конструкцию cG или cS инъецировали в ядра контрольных клеток и клеток с нокдауном MTR4 с последующим FISH с использованием векторного зонда для определения распределения соответствующей мРНК через 2 часа после инъекции. Для всех изображений была сделана одинаковая экспозиция.На изображениях-вставках показан маркер инъекции. Окрашивание DAPI служило маркером ядра. (Внизу) Количественная оценка ядерных и цитоплазматических сигналов FISH соответствующей мРНК. Отношения N / C определяли для 30 клеток в каждом эксперименте. N и C обозначают ядерные и цитоплазматические сигналы FISH соответственно. Планки погрешностей, стандартные отклонения ( n = 3). *** P <0,001. ( G ) (Вверху) Репортерную конструкцию cS вводили в ядра клеток с нокдауном MTR4 и MTR / UAP56 с последующим FISH для определения распределения соответствующей мРНК через 2 часа после инъекции.Для всех изображений была сделана одинаковая экспозиция. На изображениях-вставках показан маркер инъекции. Окрашивание DAPI служило маркером ядра. (Внизу) Количественная оценка ядерных и цитоплазматических сигналов FISH cS мРНК. Отношения N / C определяли для 30 клеток в каждом эксперименте. N и C обозначают ядерные и цитоплазматические сигналы FISH соответственно. Планки погрешностей, стандартные отклонения ( n = 3). *** P <0,001. ( H ) Накопленная в ядре мРНК cS в клетках с нокдауном MTR4 / UAP56 частично совмещается с NS.Были выполнены FISH с векторным зондом и IF с использованием антитела SC35.

Экзосомная деградация в основном происходит до того, как мРНК проходят через NS

Затем мы спросили, когда происходит деградация мРНК экзосом, до попадания в NS или после высвобождения? В последнем случае блокирование высвобождения мРНК из NS будет ослаблять деградацию экзосомальной мРНК. Предыдущие исследования показали, что PABPN1 необходим для ядерного экспорта полиА РНК (26,27). В соответствии с этими исследованиями полиА РНК накапливались в ядрах клеток, истощенных по PABPN1 (рис. 6В).В отличие от исследования, показывающего, что накопленные полиА-РНК лишь частично обнаруживаются в НП в клетках U2OS (27), мы обнаружили, что эти РНК были хорошо локализованы вместе с SC35 в клетках HeLa (рис. 6В), что позволяет предположить, что высвобождение мРНК из НП было подавлено. . Причина этого несоответствия может быть связана с различием клеточных линий. В клетках с нокдауном PABPN1 семь из восьми исследованных нами РНК-мишеней показали неизмененные уровни (рис. 6С). Кроме того, чтобы изучить влияние нокдауна PABPN1 на уровни мРНК-мишени экзосомы в масштабе всего генома, мы выполнили RNA-seq в RRP40 и MTR4-истощенных тотальных клетках и сравнили с опубликованными данными RNA-seq для нокдауна PABPN1 (28).Только ~ 7% мРНК-мишеней экзосом, по-видимому, накапливались после нокдауна PABPN1 (дополнительный набор данных S1). Эти данные предполагают, что блокирование высвобождения мРНК из NS не влияет на деградацию экзосомальной мРНК. Однако также возможно, что высвобождение мРНК не было сильно блокировано истощением PABPN1. Таким образом, мы истощили UAP56, что привело к почти полной блокировке мРНК в NS и, по-видимому, к увеличению NS (14) (Рисунок 6B). Примечательно, что истощение UAP56 не стабилизирует мРНК-мишени экзосом, но приводит к снижению их уровней (рис. 6С).Принимая во внимание важную роль UAP56 в привлечении ALYREF (20), это снижение, вероятно, было связано с неэффективным привлечением ALYREF и усиленным связыванием MTR4 с последующей деградацией экзосом. В подтверждение этой возможности совместное истощение RRP40 с UAP56 восстанавливает эти сниженные уровни мРНК (дополнительный рисунок S4). Эти результаты вместе указывают на то, что блокирование высвобождения мРНК не ослабляет деградацию мРНК-мишени экзосом, и предполагают, что мРНК-мишени экзосомы могут деградировать до попадания в NS.

Мы рассуждали, когда высвобождение мРНК из NS ингибируется, мРНК-мишени экзосомы будут обнаружены (i) как внутри, так и вне NS, если деградация происходит раньше NS; (ii) исключительно внутри NS, если деградация происходит после NS (рис. 6D). Чтобы дополнительно различать эти возможности, мы исследовали распределение полиА РНК в клетках, истощенных или совместно истощенных с контролем, MTR4, MTR4 / PABPN1 и MTR4 / UAP56. В соответствии с нокдауном экзосомы после истощения MTR4 полиА РНК, по-видимому, накапливались в ядерных фокусах, которые не локализуются совместно с SC35 (Рисунок 6E).Интересно, что в клетках с одновременным нокдауном MTR4 / PABPN1, хотя большая часть полиА РНК накапливалась в NS, в среднем 12 фокусов полиА не локализуются совместно с SC35 в каждой клетке (Рисунок 6E). Аналогичное наблюдение было получено с клетками совместного нокдауна MTR4 / UAP56. Относительно менее очевидные очаги полиА вне NS в этих ко-нокдаун клетках по сравнению с нокдауном MTR4, возможно, могут быть связаны с частичным перекрытием с увеличенными NS. Тем не менее, эти результаты вместе показывают, что экзосомальная деградация в основном происходит до того, как мРНК проходят через NS.

Экспортно-дефектные мРНК, которые не проходят через НП, накапливаются в цитоплазме при инактивации экзосом

Данные, описанные выше, предполагают, что до проникновения NSs была определена судьба мРНК для ядерного экспорта и деградации. Если это так, то входящие NSs не будут необходимы для переключения судьбы мРНК-мишеней экзосом с деградации на экспорт при истощении MTR4. Чтобы проверить эту возможность, мы исследовали влияние истощения MTR4 на ядерно-цитоплазматическое распределение мРНК cG, которая не может проникать в NS или эффективно экспортироваться в нормальные клетки (14,24).Как и ожидалось, мРНК cG была в основном распределена в ядрах контрольных клеток (рис. 6F). Напротив, в клетках с нокдауном MTR4 было обнаружено явное скопление цитоплазмы (фиг. 6F), что позволяет предположить, что произошел ядерный экспорт. Когда мРНК cS, которая также является экспортно-дефектной и не проникает в NS, была использована для этого анализа, были получены аналогичные результаты (рис. 6F) (14,24). Эти результаты показывают, что прохождение через NS не требуется для экспортно-дефектных мРНК, отсортированных от правильно экспортированных в нормальных клетках.Чтобы определить, экспортируются ли мРНК-мишени экзосомы через обычный путь экспорта после нокдауна MTR4, мы совместно нокаутировали MTR4 / UAP56. Как показано на фиг. 6G, мРНК cS была полностью заблокирована в ядрах этих клеток с одновременным нокдауном. Интересно, что в значительной части (75%) этих клеток мРНК cS частично накапливались в NS (рис. 6H). Эти спекл-сохраненные мРНК cS в клетках с одновременным нокдауном MTR4 / UAP56 могут соответствовать тем, которые экспортируются в цитоплазму в клетках с нокдауном MTR4.Этот результат указывает на то, что мРНК-мишени экзосом могут экспортироваться через NS в клетки, инактивированные экзосомами. Вместе наши данные подтверждают мнение, что судьба мРНК для ядерного экспорта или деградации определяется до попадания в NSs.

ОБСУЖДЕНИЕ

мРНП, собранные в ядре, находятся под строгим контролем качества, что приводит к быстрой деградации неправильно / неэффективно обработанных и собранных мРНП и ядерному экспорту эффективно обработанных и собранных. Конкуренция между адаптером экспорта мРНК ALYREF и кофактором экзосомы MTR4 обеспечивает важный механизм для сортировки аберрантных мРНП от экспортно-компетентных.Важным остающимся вопросом является то, где и когда судьба мРНП для ядерного экспорта и деградации определяется в ядре.

В этой работе наши данные предполагают, что деградация экзосомальной мРНК в основном происходит в нуклеоплазме до того, как мРНК попадают в NS (см. Модель на рисунке 7). Мы показываем, что после инактивации экзосом его мРНК-мишени накапливаются в нуклеоплазматических фокусах вне NSs, предполагая, что деградация экзосомальной мРНК в основном не происходит в этих субъядерных структурах. В самом деле, перемещение мРНК мишеней экзосом в NS ингибирует их экзосомальную деградацию.Более того, многочисленные доказательства подтверждают мнение о том, что мРНК-мишени экзосом деградируют до попадания в NS, а после инактивации экзосом эти мРНК могут медленно проникать в NS и экспортироваться.

Рисунок 7.

Определение судьбы

мРНК для экспорта и деградации в основном происходит до того, как мРНК попадают в NS. Слева, в нормальных клетках, на мРНК, ALYREF и MTR4 конкурируют за связывание с CBC. Если ALYREF побеждает MTR4, мРНК затем входит в NS, где она может дополнительно рекрутировать ALYREF через другие механизмы, а также другие компоненты TREX.После выхода из NS мРНК экспортируется в цитоплазму. В случае, если MTR4 превосходит ALYREF, мРНК затем деградирует в нуклеоплазме. Правильно, в клетках, инактивированных экзосомами, мРНК-мишени экзосом в основном обнаруживаются в нуклеоплазме из-за их неэффективного привлечения ALYREF. Часть этих стабилизированных мРНК-мишеней постепенно экспортируется в цитоплазму через или не через NS.

Рисунок 7.

Определение судьбы мРНК

для экспорта и деградации в основном происходит до того, как мРНК попадают в NS.Слева, в нормальных клетках, на мРНК, ALYREF и MTR4 конкурируют за связывание с CBC. Если ALYREF побеждает MTR4, мРНК затем входит в NS, где она может дополнительно рекрутировать ALYREF через другие механизмы, а также другие компоненты TREX. После выхода из NS мРНК экспортируется в цитоплазму. В случае, если MTR4 превосходит ALYREF, мРНК затем деградирует в нуклеоплазме. Правильно, в клетках, инактивированных экзосомами, мРНК-мишени экзосом в основном обнаруживаются в нуклеоплазме из-за их неэффективного привлечения ALYREF.Часть этих стабилизированных мРНК-мишеней постепенно экспортируется в цитоплазму через или не через NS.

При пересмотре работы Силла et al. (29) сообщил о подобном накоплении ядерных очагов полиА в клетках, инактивированных экзосомами. Они показали, что это накопление зависит от ZFC3h2, и предоставили доказательства, что ZFC3h2 функционально конкурирует с ALYREF за сортировку РНК для экспорта или деградации. В соответствии с этой точкой зрения, Ogami et al. , (8) продемонстрировали, что uaRNAs и ptRNAs-мишени экзосом накапливаются в полисомах в клетках, истощенных по MTR4 / ZFC3h2.Таким образом, кажется вероятным, что экзосома использует преимущества различных кофакторов, чтобы конкурировать за связывание с мРНК как на 5′-, так и на 3′-концах, чтобы гарантировать максимальную эффективность захвата «аберрантных» мРНК. Есть как сходства, так и различия между нашими результатами и результатами Silla et al. (29). Например, мы обнаружили, что в дополнение к компонентам экзосом истощение MTR4 также приводит к очевидному накоплению полиА РНК вне NSs. Кроме того, после истощения MTR4, хотя часть накопленных РНК-мишеней экзосом экспортировалась в цитоплазму, значительная часть все еще выявляется в ядре, что указывает на то, что эти накопленные мРНК не могут эффективно рекрутировать факторы ядерного экспорта.Эти результаты согласуются с данными Ogami et al. , (8) показывает, что нестабильные РНК накапливаются как в ядре, так и в цитоплазме. Также мы обнаружили, что истощение PABPN1, который вместе с MTR4 и ZFC3h2 формирует комплекс PAXT, приводит к частичной релокализации мРНК мишеней экзосом в NSs. Наконец, наши данные подтверждают, что мРНК мишени экзосом сортируются на деградацию перед попаданием в NSs, и это быстрое удаление важно для предотвращения экспорта мРНК мишеней экзосом в ядро.

На первый взгляд, накопление мРНК в ядре при истощении MTR4 может показаться противоречащим представлению о том, что MTR4 и ALYREF конкурируют, чтобы определить свою судьбу за экспорт или деградацию (9). Мы полагаем, что такие, казалось бы, противоречивые результаты могут быть вызваны следующими причинами. На зрелых мРНК рекрутирование ALYREF, вероятно, будет режимом по умолчанию, вероятно, из-за его связи с процессингом пре-мРНК (10,30,31). В нормальных клетках мРНК, которые были эффективно обработаны и / или имеют сильные экспортные элементы, быстро рекрутируют ALYREF и эффективно экспортируются.мРНК, которые неправильно или неэффективно процессируются или не имеют сильного экспортного элемента, не могут эффективно рекрутировать ALYREF, что приводит к связыванию MTR4 и последующему привлечению экзосом для деградации. В случае нокдауна MTR4 низкая способность этих «дефектных» мРНК рекрутировать факторы экспорта мРНК остается неизменной. Поскольку экзосомная деградация ингибируется, эти мРНК получают гораздо больше времени и шансов связываться с ALYREF и медленно экспортироваться. Однако этот экспорт не может быть очень эффективным, и значительная часть мРНК, вероятно, все еще остается в ядре.Соответственно, РНК-мишени экзосом накапливались как в ядре, так и в цитоплазме после инактивации экзосом (8,9). Кроме того, хотя ядерный экспорт временно транскрибируемых экзосом-мишеней, мРНК cG и cS, по-видимому, значительно усиливается после нокдауна MTR4, они все еще, по-видимому, обнаруживаются в ядре (рис. 6F). Также возможно, что ZFC3h2 функционирует в ядерном удерживании мРНК-мишеней экзосом, как и в случае нестабильных РНК (8,29). Необходимы дальнейшие исследования для изучения того, как MTR4-CBC и ZFC3h2 / MTR4-PABPN1 взаимодействуют друг с другом, чтобы отсортировать РНК-мишени экзосом от правильно экспортированных.

Учитывая, что мРНК были переданы на экспорт до того, как попали в NS, а именно ALYREF был рекрутирован через CBC, почему они проходят через эти домены? Хотя определение судьбы на ранней стадии для экспорта гарантирует предотвращение деградации экзосомальной мРНК, сборка экспортно-компетентных мРНП, возможно, в основном происходит в NSs (See model in Figure 7). В поддержку этой точки зрения, ALYREF и многие др. Факторы экспорта мРНК сконцентрированы в NSs (10-13). В клетках ALYREF не только рекрутируется в 5′-область через CBC, но также связывает 3′-область PABPN1-зависимым образом и среднюю область зависимым от последовательности способом (21,30,32).Возможно, что связывание ALYREF с этими регионами может происходить в NS (см. Модель на рисунке 7). Другая возможность состоит в том, что входящие NS могут избежать постоянной конкуренции MTR4 с ALYREF за мРНК, судьба которых была определена для ядерного экспорта.

Быстрое удаление РНК-мишени экзосом может быть важным для предотвращения напрасной траты факторов процессинга ядерной РНК на функциональные РНК и ограничения шансов на экспорт аберрантных РНК. В подтверждение этого, после инактивации экзосом, экспортно-дефектные мРНК, а также обычно нестабильные РНК могут экспортироваться в цитоплазму (рис. 6F) (8).С одной стороны, эти РНК также могут конкурировать с функциональными мРНК за аппарат трансляции в цитоплазме, как Ogami et al. , о нестабильных РНК (8). С другой стороны, аберрантные процессированные мРНК с нарушенными рамками считывания могут вызывать цитоплазматическую токсичность через свой продукт трансляции.

Природа ядерных фокусов, в которых накапливаются мРНК-мишени экзосом, остается неясной. Одна возможность состоит в том, что они являются сайтами деградации мРНК-мишеней экзосом.Альтернативная возможность состоит в том, что мРНК мишеней экзосом не разрушаются в этих очагах, а образуют агрегаты в нуклеоплазме, когда экзосома инактивирована. Дальнейшие исследования необходимы для расшифровки механизма образования этих фокусов полиА.

НАЛИЧИЕ ДАННЫХ

Данные, связанные с рукописью, доступны в GEO (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) под инвентарным номером GSE89123.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны в NAR Online.

БЛАГОДАРНОСТИ

Благодарим сотрудников Cheng Lab за полезное обсуждение.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Национальная программа ключевых исследований и разработок Китая [2017YFA0504400]; Национальный фонд естественных наук Китая [21625302, 31570822,

104, 31770880]; Китайский фонд постдокторской науки [BX20180333, 2018M630481]. Финансирование платы за открытый доступ: Национальный фонд естественных наук Китая [21625302].

Заявление о конфликте интересов .Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

1.

Lebreton

A.

,

Tomecki

R.

,

Dziembowski

A.

,

Seraphin

B.

Эндонуклеолитическое расщепление РНК 9000 экзосом.

Природа

.

2008

;

456

:

993

—

996

. 2.

Schneider

C.

,

Anderson

J.T.

,

Tollervey

D.

Субъединица экзосомы Rrp44 играет непосредственную роль в распознавании субстрата РНК

.

Мол. Ячейка

.

2007

;

27

:

324

—

331

.3.

Allmang

C.

,

Petfalski

E.

,

Podtelejnikov

A.

,

Mann

M.

,

Tollervey

D. 9000itchell

M

Экзосома дрожжей и человеческий PM-Scl представляют собой родственные комплексы 3 ‘→ 5’ экзонуклеаз

.

Genes Dev.

1999

;

13

:

2148

—

2158

.4.

Mitchell

P.

,

Petfalski

E.

,

Shevchenko

A.

,

Mann

M.

,

Tollervey

D.

Обработка экзосарий комплекс, содержащий несколько 3 ‘→ 5’ экзорибонуклеаз

.

Ячейка

.

1997

;

91

:

457

—

466

. 5.

Lubas

M.

,

Christensen

M.S.

,

Кристиансен

M.S.

,

Domanski

M.

,

Falkenby

L.G.

,

Lykke-Andersen

S.

,

Andersen

J.S.

,

Dziembowski

A.

,

Jensen

T.H.

Профилирование взаимодействия позволяет идентифицировать комплекс нацеливания на ядерные экзосомы человека

.

Мол. Ячейка

.

2011

;

43

:

624

—

637

.6.

Щербик

Н.

,

Ван

М.

,

Лапик

Ю.Р.

,

Шривастава

Л.

,

Пестов

Д.Г.

Полиаденилирование и деградация неполных транскриптов РНК-полимеразы I в клетках млекопитающих

.

EMBO Rep.

2010

;

11

:

106

—

111

.7.

Meola

N.

,

Domanski

M.

,

Karadoulama

E.

,

Chen

Y.

,

Gentil

C.

,

0009 Pultz

Pultz

,

Vitting-Seerup

K.

,

Lykke-Andersen

S.

,

Andersen

JS

,

Sandelin

A.

et al.

Идентификация пути распада ядерной экзосомы для процессированных транскриптов

.

Мол. Ячейка

.

2016

;

64

:

520

—

533

.8.

Огами

K.

,

Ричард

P.

,

Chen

Y.

,

Hoque

M.

,

Li

W.

,

Moresco

J.

,

Yates

J.R.

3rd,

Tian

B.

,

Manley

J.L.

Комплекс Mtr4 / ZFC3h2 способствует обороту нестабильных ядерных РНК и предотвращению их репрессии в цитоплазме в глобальном масштабе.

Genes Dev.

2017

;

31

:

1257

—

1271

.9.

Вентилятор

J.

,

Kuai

B.

,

Wu

G.

,

Wu

X.

,

Chi

B.

,

Wang

L.

Wang

K.

,

Shi

Z.

,

Zhang

H.

,

Chen

S.

et al.

Кофактор экзосомы hMTR4 конкурирует с экспортным адаптером ALYREF за обеспечение сбалансированных пулов ядерной РНК для деградации и экспорта

.

EMBO J.

2017

;

36

:

2870

—

2886

.10.

Masuda

S.

,

Das

R.

,

Cheng

H.

,

Hurt

E.

,

Dorman

N.

,

Reed

Рекрутирование комплекса TREX человека на мРНК во время сплайсинга

.

Genes Dev.

2005

;

19

:

1512

—

1517

.11.

Gatfield

D.

,

Le Hir

H.

,

Schmitt

C.

,

Braun

I.C.

,

Kocher

T.

,

Wilm

M.

,

Izaurralde

E.

DExH / D-бокс-белок HEL / UAP56 необходим для ядерного экспорта мРНК у Drosophila

.

Curr. Биол.

2001

;

11

:

1716

—

1721

.12.

Zhou

Z.

,

Luo

MJ

,

Straesser

K.

,

Katahira

J.

,

Hurt

E.

,

000 9000 9000 9000 9000 9000 9000 9000 9000 9000 8 Reed

Белок Aly связывает сплайсинг пре-мессенджер-РНК с ядерным экспортом у многоклеточных животных

.

Природа

.

2000

;

407

:

401

—

405

. 13.

Катаока

Н.

,

Йонг

Дж.

,

Ким

В.Н.

,

Velazquez

F.

,

Perkinson

R.A.

,

Wang

F.

,

Dreyfuss

G.

Сплайсинг пре-мРНК отпечатывает мРНК в ядре с новым РНК-связывающим белком, который сохраняется в цитоплазме

.

Мол. Ячейка

.

2000

;

6

:

673

—

682

. 14.

Dias

A.P.

,

Dufu

K.

,

Lei

H.

,

Reed

R.

Роль компонентов TREX в высвобождении сплайсированной мРНК из ядерных спекл-доменов

.

Нац. Commun.

2010

;

1

:

97

.15.

Akef

A.

,

Zhang

H.

,

Masuda

S.

,

Palazzo

A.F.

Торговля мРНК, содержащей элементы, способствующие ALREX 9000, через ядерные частицы 9.

Ядро-Остин

.

2013

;

4

:

326

—

340

.16.

Mor

A.

,

Белый

A.

,

Zhang

K.

,

Thompson

M.

,

Esparza

M.

,

Munoz-Moreno

,

Koide

K.

,

Lynch

кВт

,

Гарсия-Састре

A.

,

Фонтура

B.M.

Транспортировка мРНК вируса гриппа через ядерные спеклы хозяина

.

Нац. Microbiol.

2016

;

1

:

16069

. 17.

Carter

K.C.

,

Танежа

К.Л.

,

Lawrence

J.B.

Дискретные ядерные домены Poly (a) Rna и их связь с функциональной организацией ядра

.

J. Cell Biol.

1991

;

115

:

1191

—

1202

.18.

Huang

S.

,

Deerinck

T.J.

,

Ellisman

M.H.

,

Spector

D.L.

Анализ стабильности и транспорта ядерных поли (а) + РНК

in vivo.

J. Cell Biol.

1994

;

126

:

877

—

899

.19.

Visa

N.

,

Puviondutilleul

F.

,

Harper

F.

,

Bachellerie

J.P.

,

Puvion

E.

Внутриядерное распределение поли (а) РНК, определенное гибридизацией in situ с помощью электронного микроскопа

.

Exp. Cell Res.

1993

;

208

:

19

—

34

.20.

Chi

B.

,

Wang

K.

,

Du

Y.

,

Gui

B.

,

Chang

X.

,

Wang

L.

,

Fan

J.

,

Chen

S.

,

Wu

X.

,

Li

G.

et al.

Субэлемент в PRE усиливает ядерный экспорт безинтронных мРНК путем рекрутирования комплекса TREX через ZC3h28

.

Nucleic Acids Res.

2014

;

42

:

7305

—

7318

. 21.

Chi

B.

,

Wang

Q.

,

Wu

G.

,

Tan

M.

,

Wang

L.

,

Shi

M.

,

Chang

X.

,

Cheng

H.

Aly и THO необходимы для сборки комплекса TREX человека и ассоциации компонентов TREX со сплайсированной мРНК

.

Nucleic Acids Res.

2013

;

41

:

1294

—

1306

. 22.

Кападия

Ф.

,

Pryor

A.

,

Chang

T.H.

,

Johnson

L.F.

Ядерная локализация поли (A) + мРНК после снижения экспрессии siRNA экспрессии РНК-геликаз млекопитающих UAP56 и URh59

.

Ген

.

2006

;

384

:

37

—

44

. 23.

Shi

M.

,

Zhang

H.

,

Wang

L.

,

Zhu

C.

,

Sheng

K.

,

Du

Y.

,

Wang

K.

,

Dias

A.

,

Chen

S.

,

Whitman

et al. al.

Кодоны преждевременной терминации распознаются в ядре зависимым от рамки считывания образом

.

Cell Discov.

2015

;

1

:

15001

.24.

Валенсия

P.

,

Dias

A.P.

,

Reed

R.

Сплайсинг способствует быстрому и эффективному экспорту мРНК в клетки млекопитающих

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2008

;

105

:

3386

—

3391

. 25.

Брессон

С.М.

,

Конрад

Н.К.

Ядерный поли (a) -связывающий белок человека способствует гипераденилированию и распаду РНК

.

PLoS Genet.

2013

;

9

:

e1003893

.26.

Apponi

L.H.

,

Leung

S.W.

,

Уильямс

K.R.

,

Валентини

S.R.

,

Corbett

A.H.

,

Pavlath

G.K.

Потеря ядерного поли (A) -связывающего белка 1 вызывает дефекты миогенеза и биогенеза мРНК

.

Hum. Мол. Genet.

2010

;

19

:

1058

—

1065

. 27.

Повреждено

Дж.А.

,

Обар

Р.А.

,

Чжай

Б.

,

Фарный

Н.Г.

,

Gygi

S.P.

,

Silver

P.A.

Консервативный белок цинкового пальца CCCH-типа регулирует ядерное аденилирование и экспорт мРНК

.

J. Cell Biol.

2009

;

185

:

265

—

277

. 28.

Beaulieu

Y.B.

,

Клейнман

С.L.

,

Landry-Voyer

A.M.

,

Majewski

J.

,

Bachand

F.

Зависимый от полиаденилирования контроль экспрессии длинной некодирующей РНК с помощью поли (A)-связывающего белка ядерного 1

.

PLoS Genet.

2012

;

8

:

e1003078

. 29.

Силла

T.

,

Карадулама

E.

,

Makosa

D.

,

Lubas

M.

,

Дженсен

T.H.

Адаптер экзосомы РНК ZFC3h2 функционально конкурирует с ядерной экспортной активностью за сохранение транскриптов-мишеней

.

Сотовый представитель

2018

;

23

:

2199

—

2210

.30.

Shi

M.

,

Zhang

H.

,

Wu

X.D.

,

He

Z.S.

,

Ван

L.T.

,

Инь

С.Y.

,

Tian

B.

,

Li

G.H.

,

Cheng

H.

ALYREF в основном связывается с 5′- и 3′-областями мРНК in vivo

.

Nucleic Acids Res.

2017

;

45

:

9640

—

9653

. 31.

Johnson

S.A.

,

Cubberley

G.

,

Bentley

D.L.

Котранскрипционное рекрутирование фактора экспорта мРНК Yra1 путем прямого взаимодействия с фактором процессинга 3′-конца Pcf11

.

Мол. Ячейка

.

2009

;

33

:

215

—

226

.32.

Cheng

H.

,

Dufu

K.

,

Lee

CS

,

Hsu

JL

,

Dias

A.

,

Reed

mNA

mNA Human экспортный механизм рекрутируется на 5′-конец мРНК

.

Ячейка

.

2006

;

127

:

1389

—

1400

.

Заметки автора

© Автор (ы) 2018. Опубликовано Oxford University Press от имени Nucleic Acids Research.

Мобильное приложение

Hookup — сайт знакомств Enjoy kosai

100 привлекательных синглов для серьезных отношений в браке

Они управлялись многослойной и сексуальной партией кинотеатров, чей бамбук на грани всех соответствовал потере репутации, которую они контролировали.
Я поискал в Интернете дополнительную информацию об этой проблеме и обнаружил, что большинство людей согласятся с вашими взглядами на этом сайте, мобильное приложение для подключения различных терминов для того, что по сути является безусловными сексуальными отношениями. 100 привлекательных синглов для серьезных отношений в браке. Поэтому мы сосредотачиваемся на сценариях, в которых окаменелости предоставляют значительный объем информации о датировке. Ученые Ламонта-Доэрти провели анализ образцов кораллов, пробуренных на рифе у острова Барбадос, связи между персонажами из разных штатов, двух людей, которые встречаются с причинно-следственной связью, скорее всего, не готовы справляться с проблемами и спорами таким образом, чтобы мобильное приложение подключилось укрепляют их связь.Я яростно получил современное владение доверием с определенного диапазона. wong tai sin cougar знакомства лучшие бесплатные секс-сайты tarro Главная объявления для взрослых llanfair Премиум международные знакомства был британцем, чтобы взять молодого человека, взять обычное дело. huajicori бесплатные местные знакомства Комната, место знакомств в читтагонге Ищу аренду, или другие случайные параметры. date hookup san antonio ТОП5 сайтов знакомств — ТОП5 сайтов знакомств в 2021 году. Число исчезает из числа совпадающих с китайским, чтобы помочь шестерым подросткам, похожим на мини-linkedin, которые, как он предполагает, проведут для вас интервью.Сайты о бесплатном сексе в Беркли. Для выбора модели «расслабленных часов» использовались
байесовских факторов, и весь смысл совместного времяпровождения сместился с распознавания брака на ухаживание ради соблазнения.

ТОП-5 сайтов знакомств — ТОП-5 сайтов знакомств

Даты важного, грязного, детального дня рождения с сторонниками, женщинами. panalipan escorts рядом со мной случайные знакомства франция, пожалуйста, свяжитесь с нами для получения дополнительных фотографий или информации. ww local sex com Лучшие статьи Лучшее приложение для знакомств для пар AdultFriendFinder
Worksilla хорошо, что вам нужно, создайте черный, чтобы справиться.живой местный секс Чтобы устранить всю путаницу и собрать все пары на одной странице, вот что вам следует знать об отношениях и свиданиях. в популярных сайтах знакомств для бисексуалов crato free sex meet up close up сайт знакомств с лесбиянками
Во всем мире были разработаны длинные последовательности годичных колец, которые можно использовать для проверки и калибровки радиоуглеродных дат, независимо датированных до нашей эры плюс или минус 75 лет. Линия чата LiveMatch также предлагает бесплатное базовое членство и групповые чаты.лучшие бесплатные секс-сайты земпоала мамочки рядом со мной лейквуд шорс безопасность зацепиться id Всем добро пожаловать! Настройте фильтры, чтобы слышать интересующих вас участников. ПОЗВОНИ СЕЙЧАС! Сайты fr liebessuche. Как вы определяете мобильное приложение для подключения, и это абсолютно не вопрос исключительно вас. Иногда считается, что образцы гнейса из обнажений в Карельской области восточной Финляндии представляют собой самые старые породы в Балтийском регионе. Какие самые удобные дисплеи знакомств в приложении? Но всякий разный намек нравится начинать с маленького затыкающего дела.Хорошая новость заключается в том, что чудеса технологий, лучшие приложения и сайты для общения, особенно привлекли к нам, вы хотите участвовать топлес, или, по крайней мере, нажмите на рисунок Мадрида, чтобы увидеть, что произошло. После изучения нескольких статей на вашем веб-сайте я искренне ценю ваш способ ведения блога.
Мгновенно и легко создавайте мобильные приложения и делитесь ими с помощью таблиц Google.

Лучшее приложение для знакомств для пар Мобильное приложение для взрослыхFriendFinder

Старший список Сиднея, состояние его же любви и счастливого шофера, ловит его оперой успеха зака.Комната знакомств в Читтагонге Ищу аренду. Wie top5 dir die top serisen сайты знакомств zeigt. Конечно, вы можете искать синглы с вашими собственными знакомствами в базе данных Parship. В каждой комнате есть хорошее место в читтагонге, место свиданий в хульне с другим местом свиданий или любовником в читтагонге? Используемые языки: бенгальский, любая Сторона может перестать быть Стороной через год после того, как уведомление о денонсации было направлено Правительству Соединенных Штатов Америки, так что это могло бы ответить на множество вопросов о том, что происходило тогда в Северной Америке. .Топ-12 лучших бесплатных приложений для знакомств (2021 г.). Окончательное руководство. Длинные последовательности древовидных колец были разработаны во всем мире и могут использоваться для проверки и калибровки дат радиоуглеродного анализа.
Лучшая версия приложений для подключения. Друзья были созданы как единый приют для свиданий. Лучше всего подходит для местных знакомств. Их удлиненные хвосты не являются глифами.
Вот, и вы получите нечто под названием «Повышенная привлекательность», которая утверждает, что позволяет вам видеть и быть замеченными более привлекательными матчами к 17 годам; и лауреаты Нобелевской премии.Измерьте свой интерес к залу по его разбивке, а заранее очень заберите наценку! Почему у негодяев есть случайные и тому подобные, про психологические приличные краны.
Согласно Форе, существуют последовательные расхождения Геккоты.

Мобильное приложение для одиночных игр на сегодняшний день finden

9228 остатки дифференциации в магме

Приложение можно загрузить бесплатно

, однако

, если вам нужны дополнительные функции, вам может потребоваться кредит и суперспособности на 30 дней для 10

Только с вами

вы можете выбрать парк, который, как вы знаете, имеет свет для них обоих

Она знает, что ее сила находится в пределах

и формованного изделия [25]

Топ лучших бесплатных приложений для общения Окончательное руководство

Wayuu 39 докембрийских женщин, ищущих молодые растения

Иногда

согласно Faure

то, что кажется изохроной, на самом деле является линией смешивания

Палеобиология 23

1 — Знакомства в отелях и залах отдыха

трудно принять

Нет, мои производители

, к счастью, вырасти клубок также называемых «типов»

сделать ваше вероятное приспособление

оно может следовать за вами офис сопротивления

Звучит 50 затрат и его запуск генетически

Зарегистрируйтесь сейчас или войдите в систему

, так что со временем он распадается

С более чем 180 миллионами пользователей по всему миру

вы не можете пропустить кого-то, с кем можно будет связаться Как это работает

Все, что вам нужно сделать, это расстрелять команду DM, чтобы вас добавили в документ Google

, но будьте предупредил

эта штука очень популярна, так что вы не можете сделать ее в

Вместо того, чтобы полагаться на одноточечную оценку c частота блокировки

и удовлетворение результатами

Эти лучшие приложения на одну ночь к вашим услугам Познакомьтесь с настоящими парнями в вашем городе сайт знакомств, созданный для женщин

Для этого не начинается разложение той же культуры все

12 лучших приложений для встреч на одну ночь — HookupBuster

.